Підрахунок клітин у лічильних камерах

У камерах Горяева, Тома-Цейса, Бюркера та інших можна підрахувати великі мікробні клітини дріжджів, спори грибів, великі бактерії, одноклітинні водорості. Лічильна камера (рис.16) – це товсте предметне скло, поділене чотирма прорізами на три поперечно розташовані площадки. Центральна площадка маленьким поздовжнім прорізом поділяється на дві (чотири) рівні частини. На кожній половинці вигравійована cітка. Бічні площадки розташовані на 0,1 мм вище, ніж центральна (глибина камери), і слугують для протирання покривного скла.

а б

Рис. 16. Лічильна камера Горяєва: а – загальний вигляд,

б – збільшений фрагмент сітки (виділено один великий квадрат).

 

Сітка камери Горяєва поділена на 225 великих квадратів (15 рядків по 15 квадратів у рядку). Площа великого квадрата дорівнює 1/25 мм² і поділена на 16 малих квадратів. Сторона малого квадрата – 1/20 мм, площа – 1/400 мм², об’єм при глибині 1/10 мм – 1/4000 мм³. Частина великих квадратів розграфлена вертикально, горизонтально або не розграфлена.

Дріжджові клітини у рідких субстратах підраховують після попереднього розбавлення водою. У мірну колбу ємністю 100 см³ вносять 2, 4 або 10 см³ дріжджової суспензії залежно від передбаченої концентрації клітин. Для забарвлення мертвих дріжджових клітин додають 20 – 30 см³ метиленового синього (1:5000) або 1 – 5 см³ концентрації 1:40.

Камеру та спеціальне шліфоване покривне скло добре промити і висушити. На поверхню сітки нанести по невеликій краплині підготов­леного розбавлення і накрити покривним склом. Рідина під покривним склом має розтікатися рівномірно по всій сітці, без пухирців.

Для того щоб об’єм рідини точно відповідав розрахунковому об’єму камери, покривне скло притерти до бічних площадок камери допоки не з'являться так звані кільця Ньютона. Можна спочатку притерти покривне скло, потім за допомогою піпетки заповнити камеру суспензією мікроорганізмів. Клітини підрахувати через 3 – 5 хв після заповнення камери, щоб клітини осіли і були видними в одній площині. Рухливі форми мікроорганізмів перед нанесенням на сітку слід знищити нагріванням або додати 0,5 см³ 40 % - го розчину формаліну.

Камеру поставити на предметний столик мікроскопа і розглядати спочатку з об’єктивом 8х, потім 40х. Клітини підрахувати в п’яти (можна в десяти) великих квадратах по діагоналі або по кутках сітки і в центрі. Врахувати всі клітини, які містяться всередині великого квадрата і на суміжних лініях, якщо вони більш як наполовину лежать усередині квадрата. Клітини, які перетинаються суміжною лінією навпіл, слід рахувати на двох з чотирьох сторін квадрата; клітини, розміщенні за межами квадрата, не враховувати. Кількість клітин у 1 см³

х = (а · 4000 · в / с) / 1000,

де а – сума клітин, підрахована в п’яти (або в десяти) великих квадратах сітки; в – розбавлення вихідного субстрату; с – кількість малих квадратів, уяких проводився підрахунок.

5.2. Визначення кількості клітин методом посіву на агаризовані середовища в чашки Петрі (чашковий метод)

Метод знайшов широке застосування для визначення кількості мікроорганізмів у природних та виробничих субстратах (воді, ґрунті, сировині, напівфабрикатах і готових продуктах). Вважають, що кожна жива клітина при висіві на агаризоване середовище утворює колонію. Виконання аналізу має такі етапи.

Приготування розбавлень. Розбавлення робити у стерильній водопровідній воді або стерильному 0,5 %-му водному розчині NaСl. У процесі одного досліду користуватися постійним коефіцієнтом розбавлення, найчастіше – десятковим. Для цього стерильну воду розлити стерильною піпеткою по 9 см³ у стерильні сухі пробірки, потім перенести стерильною піпеткою 1 см³ досліджуваного матеріалу в пробірку з 9 см³ стерильної водопровідної води. Якщо досліджуваний зразок уже розбавили в 10 разів (10 г наважки внесли в колбочку з 90 см³ стерильної води), одержують розбавлення 1:10². Суспензію одержаного розбавлення ретельно перемішати за допомогою стерильної піпетки, вбираючи в піпетку і випускаючи з неї отриману завись. Цю процедуру повторити 3 – 5 разів, що дає можливість перемішувати суспензію і зменшити адсорбцію клітин на її стінках. Потім цією самою піпеткою 1 см³ одержаного розбавлення перенести у другу пробірку (це розбавлення 1:10³), з другої – в третю (1:10⁴) і т.д.

Посів на агаризовані середовища в чашки Петрі. В стерильні чашки Петрі налити по 10 – 15 см³ розплавленого у киплячій водяній бані агаризованого середовища, залишити на горизонтальній поверхні доти, поки агар не застигне.

Посів робити з певних розбавлень залежно від передбаченої кількості мікроорганізмів у досліджуваному зразку. Стерильною піпеткою нанести певний об'єм (0,05; 0,1 або 0,2 см³) відповідного розбавленняна поверхню агарової пластинки чашки Петрі і розтерти по поверхні середовища стерильним шпателем (рис. 17.)

Рис. 17. Схема приготування розбавлень мікроорганізмів і посіву

З кожного розбавлення так само зробити чотири-шість паралельних висівів. Для паралельних посівів з одного розбавлення можна користуватися однією стерильною піпеткою і одним шпателем. Для посівів з різних розбавлень використовувати нову стерильну піпетку і новий шпатель.

Чашки із засіяними середовищами перевернути догори дном і помістити у термостат, відрегульований на температуру, сприятливу для розвитку тих мікроорганізмів, які виділяють у досліді.

Колонії, що виросли, підрахувати через певний час після посіву, який залежить від швидкості росту мікроорганізмів на середовищі, використаному в досліді. Описати колонії, мікроскопувати їх і визначити основні групи мікроорганізмів, що інфікують середовище. Підрахувати кількість колоній, які виросли при посіві з певного розбавлення на одній або кількох чашках Петрі. Результати паралельних посівів підсумувати і визначити середнє число колоній, які виросли при посіві даного розбавлення.

 

 

Завдання на виконання

1. Приготувати препарати "роздавлена крапля" сахароміцетів, ши-зосахароміцетів, сахаромікодів.

2. Ознайомитись з морфологію дріжджів: форма клітин, способи розмноження - Saccharomyces cerevisiae, Shizosaccharomyces pombe, Saccharomycodes ludwigii. Визначити під мікроскопом розмір, фор­му і стан цитоплазми клітин кожної родини.Зарисувати зображення сфокусовані в полі зору.

3. Приготувати препарати "роздавлена крапля" дріжджів: Candida albicans, Trichosporon cutaneum, Candida scottii, Rhodotorula glutinis. Звернути увагу на форму, розмір, розгалуження клітин, наявність жирових включень. Зарисувати зображення.

4. Ознайомитись з віковими особливостями молодих, зрілих і старих культур дріжджів Saccharomyces cerevisiae. Виконати вітальне фарбування дріжджів метиленовим синім і розчином Люголя. Визначити відсоток: брунькуючих клітин, клітин з глікогеном, мертвих клітин. Зображення зарисувати.

5. Вивчити способи розмноження дріжджів, звертаючи увагуна бруньки й перегородки.

6. Ознайомитись з культуральними ознаками дріжджів на прикладі гігантських колоній.

Опрацювання результатів

1. Після ознайомлення з морфологією кожного з представників дріжджів необхідно виконати рисунок у робочому зошиті (рис. 7) підписи рисунків повинні містити родову та видову назви досліджуваних культур на латині.

2. Після ознайомлення з віковими особливостями молодих, зрілих і старих культур дріжджів крім виконання рисунків відповідних об’єктів у зошиті необхідно також підрахувати за допомогою лічильної камери відсотковий вміст відповідно брунькуючих клітин, клітин з глікогеном та мертвих клітин.

3. Вивчивши способи розмноження дріжджів, ознайомившись з морфологічними і віковими особливостями, а також з культуральними ознаками дріжджів необхідно скласти паспорт розглянутих культур (табл.1.).

Таблиця 1.

Клас	Роди-на	Рід	Вид і раса	Форма клітин	Розмір клітин	Спосіб вегетативного розмноження	Утворе-ння спор	При-мітки

Контрольні запитання

1. Які розміри мають клітини дріжджів?

2. Які способи вегетативного розмноження дріжджів?

3. Галузі застосування дріжджів роду Saccharomyces.

4. Особливості шизосахароміцетів і сахаромікодів.

5. Застосування дріжджів роду Candida, Trichosporon, Rodotorula.

6. За якими ознаками відрізняються молоді, зрілі й старі дріжджові клітини?

7. Як виявляють резервні речовини у дріжджових клітинах?

8. Культуральні особливості дріжджів.

9. Будова камери Горяєва.

10. Методика підрахунку дріжджів у камері Горяєва.

11. Визначення кількості клітин за методом Коха.

 

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА 3