Поживні середовища для культивування мікроорганізмів і способи стерилізації

Склад і призначення поживних середовищ. До складу поживних середовищ мають входити органічні елементи (C, H, О, N), зольні елементи (Р, S, К, Ca, Mg, Fe ) і деякі мікроелементи (Mn, Cu, Na, Cl, Zn, B, Mo) тощо у формі сполук, що легко засвоюються мікроорганізмами. Вуглець споживають мікроорганізми-гетеротрофи у формі глюкози, інших цукрів, органічних кислот, спиртів та інших сполук. Джерелом азоту можуть бути білки, пептони, амінокислоти. Решту елементів вводять у вигляді солей. Джерелом факторів росту можуть бути дріжджові екстракти або автолізати.

За складом поживні середовища поділяютьсяна природні (натуральні) та штучні (синтетичні).

Натуральні середовища готують із продуктів тваринного або рослинного походження (наприклад шматки картоплі, моркви, м’ясна вода, гідролізоване молоко, солодове сусло, дріжджова вода та ін.). Їх використовують для вирощування мікроорганізмів, нагромадження біомаси, зберігання чистих культур, але вони мало підходять для вивчення фізіології обміну речовин.

До складу синтетичних середовищ входять точно вказані концентрації певних органічних або неорганічних хімічних сполук (амінокислот, цукрів, мінеральних солей, вітамінів). Наприклад, середовище Рідер для вирощування дріжджів, середовище Чапека для грибів та ін. Їх використовують для дослідження обміну речовин, виявлення закономірностей росту чи біосинтезу яких-небудь метаболітів та ін.

За призначенням розрізняють універсальні,селективні та диференціально-діагностичні середовища. До універсальних належать середовища, сприятливі для росту багатьох видів мікроорганізмів (м’ясопептонний бульйон (МПБ), неохмелене пивне сусло та ін.). Елективні, або вибіркові, середовища забезпечують розвиток лише певних мікроорганізмів чи груп споріднених видів. Диференціально-діагностичні, або індикаторні, середовища використовують для диференціювання видів мікроорганізмів (наприклад середовище Ендо та ін.).

За консистенцією поживні середовища бувають щільними, рідкими і сипкими. Рідкі середовища застосовують для нагромадження біомаси мікроорганізмів, дослідження їх фізіолого-біохімічних властивостей, рідше – для зберігання, щільні – для виділення чистих культур, одержання ізольованих колоній, зберігання чистих культур у музеях та ін. Сипкі середовища (висівки, пшоно, буряковий жом, макуха та ін.) використовують для зберігання деяких видів мікроорганізмів та їх спор, приготування посівного матеріалу.

Для одержання щільних середовищ використовують агар, желатин і кремнекислий гель. Агар – складний полісахарид, його добувають із морських водоростей шляхом екстракції під час кип’ятіння. Готовий агар – це порошок, пластинки або стебельця світло-жовтого кольору. У воді набрякає, розм’якшується й утворює гель, що плавиться при температурі 100 °С і застигає при 40 °С. До середовищ додають 1,5 – 3 % агару.

Желатин – білок, який одержують виварюванням кісток, хрящів, сухожиль тварин. Желатиновий гель плавиться при температурі 22 – 26,5 °С, залежно від його концентрації в середовищі.

Кремнекислий гель (силікагель) готують змішуванням рівних об’ємів HCl і рідкого скла (Na₂SiO₂ або К₂SiO₂).

Поживні середовища мають бути збалансовані за своїм складом, ізотонічні за концентрацією розчинних речовин, повинні мати оптимальну для росту певного мікроорганізму реакцію середовища (рН) і в’язкість.

Приготування поживних середовищ. Для готування поживних середовищ використовують чистий посуд, що не містить сторонніх речовин. Краще користуватися скляним посудом (колби, флакони, склянки, матраци, пробірки і т.д.). Новий скляний посуд миють і занурюють на 8 – 10 год у 1 – 2 %-й розчин соляної або сульфатної кислоти або кип'ятять у підкисленій воді, потім ретельно прополіскують спочатку проточною водопровідною, потім здистильованою водою і сушать. Використаний посуд миють йоржами або щітками в теплій воді, застосовуючи кальциновану соду, мильний розчин, напіврідке мило або синтетичні миючі засоби, прополіскують спочатку проточною водопровідною, потім дистильованою водою. Дуже забруднений посуд із залишками жиру обробляють хромовою сумішшю і ретельно промивають водою. Сушать посуд при кімнатній температурі або в сушильній шафі, закривають ватяними пробками з паперовими ковпачками і зберігають у захищеному від пилу місці.

Рідкі поживні середовища фільтрують через паперовий або полотняний фільтр і розливають у пробірки за допомогою лійок з короткою гумовою трубкою, затискачем Мору і скляним наконечником. Для ущільнення рідких середовищ вносять потрібну кількість агару і нагрівають на киплячій водяній бані до повного розчинення. Розплавлені агаризовані середовища фільтрують через ватно-марлеві фільтри і розливають за допомогою металевих лійок для гарячого фільтрування. Для одержання скошеного агару пробірки заповнюють на 1/2 висоти, заповнення чашок – на 2/3 (краще використовувати пробірки великого об’єму), потім стерилізують. Можна не розливати у пробірки, а стерилізувати середовище в колбах. Пробірки і колби перед стерилізацією закривають ватяними пробками. Після стерилізації пробірки для скошеного агару встановлюють у похилому положенні і залишають для застигання. Середовище має не доходити до ватяної пробки на 5 – 6 см.

Желатин, що додається в рідкі середовища, залишають для набрякання на 10 – 15 хв, потім нагрівають у водяній бані до повного розчинення.

Зберігають стерильні поживні середовища у прохолодному, помірно сухому приміщенні, у щільно закритих шафах, захищених від дії світла і висихання. У сирих приміщеннях ватяні пробки вбирають вологу, що приводить до розвитку міцеліальних грибів, що згодом можуть потрапити усередину колб і пробірок. На кожну колбу із середовищем прикріплюють етикетки зі складом (або назвою) і датою приготування.

Визначення рН поживних середовищ. Для визначення рН використовують потенціометри (рН-метри лабораторні) різних марок:
рН-121, рН-340, рН-150М, ЭВ-74 та ін.

Стерилізація поживних середовищ. Стерилізацією, або знеплідненням, називають повне знищення вегетативних клітин та їхніх спор у будь-якому матеріалі – поживному середовищі, посуді, інструментах та ін. Вибір способу стерилізації залежить від властивостей об’єкта, що стерилізується. Для стерилізації можна застосовувати такі прийоми.

Автоклавування – стерилізація в автоклавах насиченою парою під тиском 0,05 – 0,2 МПа. Температура насиченої пари при різному тиску наведена в таблиці 2.

Таблиця 2.