Спектрофотометрія відрізняється від фотоколориметрії тим, що аналіз здійснюють за поглинанням речовинами монохроматичного випромінювання в ультрафіолетовій, видимій та інфрачервоній областях спектра.
Аналіз речовин проводиться або за відомими параметрами спектра поглинання досліджуваної речовини, або за порівнянням спектрів поглинанням розчину стандартної речовини і розчину досліджуваної речовини одного і того ж складу, які одержані в однакових умовах.
Спектрофотометричні визначення ґрунтуються на законі Бугера-Ламберта-Бера, але, на відміну від фотоколориметричних досліджень, можна аналізувати не лише забарвлені, а й безбарвні розчини, проводячи в останньому випадку вимірювання в ультрафіолетовій чи інфрачервоній областях спектра.
Спектрофотометрія має ряд переваг над фотоколориметрією:
§ одночасне кількісне визначення декількох компонентів багатокомпонентних сумішей, оскільки кожен компонент має максимум поглинання при певній довжині хвилі;
§ визначення складу та констант нестійкості комплексних сполук;
§ визначення констант йонізації кислот, основ та ін.,
Спектрофотометри забезпечують монохроматичне випромінювання не за допомогою світлофільтрів, як у фотоколориметрії, а за допомогою спеціальних оптичних пристроїв – монохроматорів, які дозволяють безперервно змінювати довжину хвилі випромінювання, яке проходить через розчин досліджуваної речовини.
У спектрофотометричному аналізі, як і у фотоколориметрії, необхідно створювати оптимальні умови для досягнення певної точності та відтворюваності результатів. Відносна похибка спектрофотометричних визначень індивідуальних речовин не перевищує 2%.
При вимірюванні в ультрафіолетовій області та видимій частині спектра придатні розчинники, які не містять домішок, що поглинають у даній спектральній області. Як розчинники використовують воду, спирти, хлороформ, розчини кислот та лугів.
Концентрацію розчину та товщину шару розчину, через який проходить світло, підбирають таким чином, щоб значення оптичної густини знаходилося у межах 0,2-0,7, що забезпечує мінімальну похибку вимірювань.
Для перевірки правильності показників спектрофотометрів, готують розчин калій дихромату, що містить 60,06 мг K2Cr2O7 в 1 дм 3 розчину сульфатної кислоти, с =0,005 моль/дм 3. Величини оптичних густин для зазначеного розчину при різних довжинах хвиль мають бути такими:
| λ =235 нм | D =0,748 |
| λ =257 нм | D =0,845 |
| λ =313 нм | D =0,292 |
| λ =350 нм | D =0,640 |
Основним методом визначення концентрацій розчинів є порівняння оптичних густин стандартного та досліджуваного розчинів:
Іншим методом визначення концентрації розчину є використання калібрувального графіка. Готують серію стандартних розчинів досліджуваної речовини, визначають їх оптичні густини та будують графік у системі С–D. Вимірюють оптичну густину досліджуваного розчину та визначають його концентрацію за калібрувальним графіком.
Крім того, концентрацію розчину можна визначити за середнім значенням молярного коефіцієнта поглинання за формулою:
D = ε · c; 
;
При високих концентраціях розчинів, коли оптична густина стає більшою за одиницю, різко зростає похибка як фотоколориметричних, так і спектрофотометричних вимірювань.
