Ћекции.ќрг


ѕоиск:




 атегории:

јстрономи€
Ѕиологи€
√еографи€
ƒругие €зыки
»нтернет
»нформатика
»стори€
 ультура
Ћитература
Ћогика
ћатематика
ћедицина
ћеханика
ќхрана труда
ѕедагогика
ѕолитика
ѕраво
ѕсихологи€
–елиги€
–иторика
—оциологи€
—порт
—троительство
“ехнологи€
“ранспорт
‘изика
‘илософи€
‘инансы
’ими€
Ёкологи€
Ёкономика
Ёлектроника

 

 

 

 


MiRNA-223 - регул€тор пролиферации и активации нейтрофилов




ћногими исследовани€ми показано: экспресси€ miRNA-223 св€зана с миелоидными клетками в костном мозгу; она повышаетс€ при дифференцировке миелоидных предшественников в гранулоциты. »нтересны наблюдени€ за мышами с нокаутом гена miRNA-223, которые оставались здоровыми и у них обнаруживалось повышенное число предшественников гранулоцитов в костном мозгу и зрелых

нейтрофилов в циркул€ции. —читаетс€, что miRNA-223 вовлечена в негативную регул€цию созревани€, но не дифференцировки гранулоцитов. ƒействие miRNA-223, веро€тно, опосредовано через отрицательное вли€ние другого миелоидного фактора (подобного ELF-1). Ётот транскрипционный фактор участвует в пролиферации клеток миелоидного р€да. ‘ункциональные исследовани€ циркулирующих нейтрофилов нокаутных животных показали: miRNA-223 не вовлечена в выход клеток из сосудистого русла, миграцию или фагоцитоз ими Escherichia coli. ќднако уменьшение количества miRNA- 223 приводит к усилению кислородного взрыва и цитотоксического ответа на действие грибов Candida albicans. ” животных, нокаутных по miRNA-223, спонтанно развиваютс€ воспалительные процессы в легких и наблюдаетс€ повышенное разрушение тканей после воздействи€ эндотоксинов. ќбнаруживаетс€ быстрое и селективное увеличение экспрессии miRNA-223 в эпителии легких и бронхов после аэрозольного воздействи€ токсином. Ѕольшое количество факторов может регулировать экспрессию miRNA-223 в процессе дифференцировки и созревани€ гранулоцитов.

“аким образом, накапливаетс€ все больше фактов, свидетельствующих о том, что микро–Ќ  представл€ет собой новый большой класс регул€торных молекул, участвующих во многих физиологических процессах организма. ¬ажную роль микро–Ќ  играют в развитии врожденного иммунного ответа. ¬ основном эти молекулы блокируют или активируют адаптерные молекулы, которые необходимы дл€ проведени€ сигнала с рецепторов врожденного иммунитета или дл€ регул€ции факторов транскрипции, участвующих в дифференцировке и созревании различных клеток врожденного иммунитета. ¬ажно, что данные молекулы реализуют свое действие на посттранскрипционном уровне, благодар€ чему изучение микро–Ќ  представл€ет интерес, ибо, веро€тно, оно будет способствовать более глубокому пониманию механизмов регул€ции врожденного иммунитета. —ледует отметить перспективность такого направлени€ исследований, так как с каждым годом возрастает количество данных о возможност€х miRNA регулировать врожденный иммунитет. Ќесомненно: miRNA вскоре станут основой дл€ создани€ перспективных лекарственных средств, дающих эффект строго направленной коррекции нарушений врожденного иммунитета. —тановитс€ очевидной и необходимость разработки новых подходов к синтезу miRNA, изучению механизмов

 

их действи€, поиску молекул-мишеней и новых методов тестировани€, основанных в первую очередь на принципе ѕ÷– (см. табл. 6.1).

¬ насто€щее врем€ известно несколько методов дл€ определени€ экспрессии генов микро–Ќ  в биологических образцах.

ѕервым методом анализа €вл€етс€ Northern blot. ќн хорошо изучен и описан, однако довольно трудоемок, а кроме того, существует много ограничений использовани€ образцов. ƒл€ определени€ зрелой микро–Ќ  в пробе общую –Ќ  нанос€т на 12% денатурирующий полиакриламидный гель. ¬ качестве маркера используют низкомолекул€рный олигонуклеотид. ѕосле электрофореза пробы помещают на мембрану и провод€т гибридизацию с олигонуклеотидными пробами (меченными 32– изотопом или другой меткой), комплементарными зрелой форме изучаемой микро–Ќ . ƒалее мембраны отмывают от несв€завшихс€ олигонуклеотидных последовательностей и осуществл€ют детекцию с помощью радиочувствительной пленки (если метка 32–).

¬ последнее врем€ дл€ обнаружени€ молекул микро–Ќ  в биологическом образце используют метод микрочипов (см. выше). ќн позвол€ет исследовать образец на наличие одновременно большого количества молекул микро–Ќ . Ќедостаток такого подхода - необходимость содержани€ в образце больших количеств исследуемой –Ќ , что не всегда возможно.

»з клеточной культуры, в которой нужно определить микро–Ќ , выдел€ют общую –Ќ . ¬ыделенный материал инкубируют с малыми последовательност€ми –Ќ , меченными флуоресцентными метками (Cy5, Cy3 и др). ƒалее меченый образец наноситс€ на микрочип, содержащий ƒЌ -последовательности известных (по крайней мере 200) молекул микро–Ќ . ѕосле инкубации в течение 14 ч происходит гибридизаци€ и затем планшет отмываетс€. –езультат считываетс€ при помощи флуоресцентного сканера (методически процесс описан выше). ѕо свечению в лунках планшета определ€ют, какой из 200 образцов микро–Ќ  экспрессируетс€ в пробе.

 

Ќовый метод дл€ определени€ уровн€ экспрессии генов микро–Ќ  - количественна€ обратна€ транскрипци€ с ѕ÷– (ќ“-ѕ÷–) (см. выше). Ётот метод имеет высокую специфичность и чувствительность.

„тобы исследовать микро–Ќ  с помощью ѕ÷–, необходимо модифицировать последнюю, ибо праймеры в обычной системе дл€ ѕ÷– имеют тот же размер, что и исследуема€ микро–Ќ . –азработан

новый методический подход, основанный на модификации ѕ÷–, названный miR-Q. ѕервым шагом в данной методике €вл€етс€ встраивание последовательности искомой микро–Ќ  в кƒЌ  с известной последовательностью. Ёто осуществл€етс€ при реакции обратной транскрипции. ѕосле провод€т ѕ÷– и детекцию полученного амплификата2.

¬опросы и задани€

1.  акие молекул€рно-генетические методы используютс€ дл€ решени€ иммунологических задач?

2. ƒайте определение термина Ђполимеразна€ цепна€ реакци€ї и опишите суть метода.

3.  акие существуют модификации ѕ÷–, примен€емые в иммунологии? ѕочему они используютс€?

4. Ќарисуйте схему последовательности этапов ѕ÷–.

5. ќпишите трудности, возникающие при постановке ѕ÷–.

6. ѕеречислите преимущества ѕ÷– перед другими методическими подходами.

7. „то такое микрочипы?

8.  акие виды микрочипов вы знаете?

9.  акие иммунологические цели достижимы при использовании микрочипов?

10. ќпишите метод получени€ мышей с нокаутом (knock-out) и нокином (knock-in) генов.

11.  ак получить трансгенную мышь?

12. „то такое регул€торные микро–Ќ ?

13.  аким образом регул€торные микро–Ќ  могут быть применены в иммунологических исследовани€х?

14. Ќазовите основные методы дл€ определени€ микро–Ќ .

15. „то такое гибридомы?

16. ƒайте определение моноклональных антител.

17. ќпишите этапы получени€ гибридом.

18. ѕроиллюстрируйте принципы метаболической селекции клеток.

 

√лава 7

ћетоды оценки системы цитокинов

¬ насто€щей главе будет рассмотрен комплексный подход в оценке системы цитокинов с использованием описанных ранее современных методов исследовани€.

¬начале мы изложим основные представлени€ о системе цитокинов.

÷итокины в насто€щее врем€ рассматривают как белковопептидные молекулы, продуцируемые различными клетками организма и осуществл€ющие межклеточные и межсистемные взаимодействи€. ÷итокины - универсальные регул€торы жизненного цикла клеток, они контролируют процессы дифференцировки, пролиферации, функциональной активации и апоптоза последних.

÷итокины, продуцируемые клетками иммунной системы, называют иммуноцитокинами; они представл€ют собой класс растворимых пептидных медиаторов иммунной системы, необходимых дл€ ее развити€, функционировани€ и взаимодействи€ с другими системами организма ( овальчук Ћ.¬. и соавт., 1999).

явл€€сь регул€торными молекулами, цитокины играют важную роль в осуществлении реакций врожденного и адаптивного иммунитета, обеспечивают их взаимосв€зь, контролируют гемопоэз, воспаление, заживление ран, образование новых кровеносных сосудов (ангиогенез) и многие другие жизненно важные процессы.

¬ насто€щее врем€ существует несколько различных классификаций цитокинов, учитывающих их строение, функциональную активность, происхождение, тип цитокиновых рецепторов. “радиционно, в соответствии с биологическими эффектами, прин€то выдел€ть следующие группы цитокинов.

1. »нтерлейкины (»Ћ-1-»Ћ-33) - секреторные регул€торные белки иммунной системы, обеспечивающие медиаторные взаимодействи€ в иммунной системе и св€зь ее с другими системами организма. »нтерлейкины раздел€ют по функциональной активности на про- и противовоспалительные цитокины, ростовые факторы лимфоцитов, регул€торные цитокины и др.

3. ‘акторы некроза опухоли (‘Ќќ) - цитокины с цитотоксическим и регул€торным действи€ми: ‘Ќќа и лимфотоксины (Ћ“).

4. ‘акторы роста гемопоэтических клеток - фактор роста стволовых клеток (Kit - ligand), »Ћ-3, »Ћ-7, »Ћ-11, эритропоэтин, тробопоэтин, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор - √ћ- —‘, гранулоцитарный  —‘ - √- —‘, макрофагаль-

ный  —‘ - ћ- —‘).

5. ’емокины - —, ——, —’— (»Ћ-8), —’3— - регул€торы хемотаксиса различных типов клеток.

6. ‘акторы роста нелимфоидных клеток - регул€торы роста, дифференцировки и функциональной активности клеток различной тканевой принадлежности (фактор роста фибробластов - ‘–‘, фактор роста эндотелиальных клеток, эпидермальный фактор роста - Ё‘– эпидермиса) и трансформирующие факторы роста (“‘–β, “‘–α).

—реди прочих в последние годы активно изучаетс€ фактор, ингибирующий миграцию макрофагов (миграцию ингибирующий фактор - ћ»‘), который рассматриваетс€ как нейрогормон с цитокиновой и ферментной активностью (—услов ј.ѕ., 2003;  овальчук Ћ.¬. и соавт.,

2004).

÷итокины различаютс€ по строению, биологической активности и другим свойствам. ќднако нар€ду с различи€ми цитокины обладают общими свойствами, характерными дл€ данного класса биорегул€торных молекул.

1. ÷итокины - это, как правило, гликозилированные полипептиды средней молекул€рной массы (менее 30 кD).

2. ÷итокины вырабатываютс€ клетками иммунной системы и другими клетками (например, эндотелием, фибробластами и др.) в ответ на активирующий стимул (патогенассоциированные молекул€рные структуры, антигены, цитокины и др.) и участвуют в реакци€х врожденного и адаптивного иммунитета, регулиру€ их силу и продолжительность. Ќекоторые цитокины синтезируютс€ конститутивно.

3. —екреци€ цитокинов - короткий по времени процесс. ÷итокины не сохран€ютс€ как преформированные молекулы, а их

 

синтез начинаетс€ всегда с транскрипции генов.  летки вырабатывают цитокины в низкой концентрации (пикограммы на миллилитр).

4. ¬ большинстве случаев цитокины продуцируютс€ и действуют на клетки-мишени, наход€щиес€ в непосредственной близости (короткодистантное действие). ќсновное место действи€ цитокинов - межклеточный синапс.

5. »збыточность системы цитокинов про€вл€етс€ в том, что каждый тип клеток способен продуцировать несколько цитокинов, а каждый цитокин может секретироватьс€ различными клетками.

6. ƒл€ всех цитокинов характерна плейотропность, или полифункциональность действи€. “ак, про€вление признаков воспалени€ обусловлено вли€нием »Ћ-1, ‘Ќќα, »Ћ-6, »Ћ-8. ƒублирование функций обеспечивает надежность работы системы цитокинов.

7. ƒействие цитокинов на клетки-мишени опосредуетс€ высокоспецифичными высокоаффинными мембранными рецепторами, представл€ющими собой трансмембранные гликопротеины, состо€щие, как правило, более чем из одной субъединицы. ¬неклеточна€ часть рецепторов ответственна за св€зывание цитокина. —уществуют рецепторы, устран€ющие избыток цитокинов в патологическом очаге. Ёто так называемые рецепторы-ловушки. –астворимые рецепторы представл€ют собой внеклеточный домен мембранного рецептора, отделенный с помощью фермента. –астворимые рецепторы способны нейтрализовывать цитокины, участвовать в транспорте их в очаг воспалени€ и в выведении из организма.

8. ÷итокины работают по принципу сети. ќни могут действовать согласованно. ћногие функции, приписываемые первоначально одному цитокину, как оказалось, обусловлены согласованным действием нескольких цитокинов (синергизм действи€). ѕримерами синергического взаимодействи€ цитокинов €вл€ютс€ стимул€ци€ воспалительных реакций (»Ћ-1, »Ћ-6 и ‘Ќќа), а также синтеза IgE

 

(»Ћ-4, »Ћ-5 и »Ћ-13).

ќдни цитокины индуцируют синтез других цитокинов (каскад).  аскадность действи€ цитокинов необходима дл€ развити€ воспалительных и иммунных реакций. —пособность одних цитокинов усиливать или ослабл€ть продукцию других обусловливает важные позитивные и негативные регул€торные механизмы.

»звестно антагонистическое действие цитокинов, например продукци€ »Ћ-6 в ответ на увеличение концентрации ‘Ќќа может быть

негативным регул€торным механизмом контрол€ выработки этого медиатора при воспалении.

÷итокинова€ регул€ци€ функций клеток-мишеней осуществл€етс€ с помощью аутокринного, паракринного или эндокринного механизмов. Ќекоторые цитокины (»Ћ-1, »Ћ-6, ‘Ќќα и др.) способны участвовать в реализации всех перечисленных механизмов.

ќтвет клетки на вли€ние цитокина зависит от нескольких факторов:

Х от типа клеток и их исходной функциональной активности;

Х от локальной концентрации цитокина;

Х от присутстви€ других медиаторных молекул.

“аким образом, клетки-продуценты, цитокины и специфические дл€ них рецепторы на клетках мишен€х формируют единую медиаторную сеть. »менно набор регул€торных пептидов, а не индивидуальные цитокины, определ€ют окончательный ответ клетки. ¬ насто€щее врем€ система цитокинов рассматриваетс€ как универсальна€ система регул€ции на уровне целостного организма, обеспечивающа€ развитие защитных реакций (например, при инфекции).

¬ последние годы сложилось представление о системе цитокинов, объедин€ющей:

1) клетки-продуценты;

2) растворимые цитокины и их антагонисты;

3) клетки-мишени и их рецепторы (рис. 7.1).

Ќарушени€ различных компонентов системы цитокинов привод€т к развитию многочисленных патологических процессов, а потому вы€вление дефектов в этой регул€торной системе имеет важное значение дл€ правильной постановки диагноза и назначени€ адекватной терапии.

 

¬начале рассмотрим основные компоненты системы цитокинов.





ѕоделитьс€ с друзь€ми:


ƒата добавлени€: 2015-02-12; ћы поможем в написании ваших работ!; просмотров: 542 | Ќарушение авторских прав


ѕоиск на сайте:

Ћучшие изречени€:

¬аше врем€ ограничено, не тратьте его, жив€ чужой жизнью © —тив ƒжобс
==> читать все изречени€...

1899 - | 1845 -


© 2015-2024 lektsii.org -  онтакты - ѕоследнее добавление

√ен: 0.016 с.