Ћекции.ќрг


ѕоиск:




 атегории:

јстрономи€
Ѕиологи€
√еографи€
ƒругие €зыки
»нтернет
»нформатика
»стори€
 ультура
Ћитература
Ћогика
ћатематика
ћедицина
ћеханика
ќхрана труда
ѕедагогика
ѕолитика
ѕраво
ѕсихологи€
–елиги€
–иторика
—оциологи€
—порт
—троительство
“ехнологи€
“ранспорт
‘изика
‘илософи€
‘инансы
’ими€
Ёкологи€
Ёкономика
Ёлектроника

 

 

 

 


ћетод направленного мутагенеза

ћетод нокаута/нокина генов (т.е. удалени€ или добавлени€ определенного гена или генов в геном организма) - это метод получени€ клеток или целых организмов (мышей), в которых целенаправленно разрушен определенный ген или встроен дополнительный ген. ƒл€ осуществлени€ подобного необходимо иметь:

 

1) клонированный заданный ген;

2) два Ђметодическихї гена дл€ селекции искомых клеток с удачно инактивированным геном и соответствующую селективную среду культивировани€;

3) особую уникальную линию перевивных стволовых эмбриональных мышиных клеток - ES (embryonic stem cell line), сохран€ющих способность дифференцироватьс€ в надлежащих услови€х во все типы клеток организма мыши, включа€ гаметы;

4) здоровых мышей и трудолюбие примерно на год упорной работы.

Ёванс,  ауфман и соавт. опубликовали в ЂNatureї работу о выведении перевиваемой (трансформированной) линии эмбриональных стволовых клеток - ES (embryonic stem cells). Ќезависимо от них аналогичную работу выполнил G. Martin и опубликовал ее в том же

1981 г. в PNAS. Ёти перевивные линии клеток авторы получили из эмбрионов мышей на самых ранних стади€х развити€ - стади€х бластулы, вывод€ их в культуру на подслой фидерных клеток - эмбриональных фибробластов в присутствии факторов, подавл€ющих дифференцировку (например, LIF - leukemia inhibitory factor).

ѕозже разные авторы вывели несколько линий и сублиний ES (D3, CCE, AB-1, E14TG2a, J1, R1, HM-1 и др.). ƒанные клетки используют дл€ создани€ мутантных мышей - с отсутствием определенного гена (генетический нокаут) или с введением лишнего гена (генетический нокин) в исследовательских цел€х. ћассовый характер работы по генетическому нокауту прин€ли с 1991 г. –аботы по выведению эмбриональных стволовых клеток человека имеют место, но в насто€щее врем€ такие работы Ђне принимаютї в ответственном научном сообществе по двум причинам:

1) всегда подозреваетс€ трансформированность перевиваемых in vitro клеток, т.е. возможность их опухолевого перерождени€, что дл€ подавл€ющего большинства биологов и медиков €вл€етс€ абсолютным запретом на применение эмбриональных стволовых клеток у людей;

 

2) в насто€щее врем€ нет благоразумных аргументов дл€ оправдани€ работ по созданию запланированных кем бы то ни было людей-мутантов, аналогичных мышам с генетическим нокаутом или нокином.

ћетодики удалени€/встраивани€ генов основаны на природном феномене гомологичной рекомбинации. ѕри половом размножении живых организмов природа Ђпредусмотрелаї мейоз и кроссинговер в мейозе, при котором происход€т физическое сближение гомологичных генов в гомологичных хромосомах и обмен участками ƒЌ  между гомологичными генами. ќказываетс€, если в клетку ввести отдельный ген, то он тоже в состо€нии найти в хромосомах гомологичный себе ген (одноименный) и вступить с ним в гомологичную рекомбинацию, т.е. произвести обмен участками ƒЌ . ƒл€ направленного мутагенеза (или нокаута) заданного гена в клетку ввод€т не интактный гомологичный ген, а умышленно поврежденный. ƒальше все происходит по природным механизмам: поврежденный, но гомологичный экзоген находит одноименный интактный клеточный ген, вступает с ним в гомологичную рекомбинацию, и в результате в хромосоме на месте прежнего интактного гена по€вл€етс€ поврежденный Ђподлогї. ÷ель достигнута.

”читыва€ выдающиес€ возможности этой методики, опишем ее подробнее. ¬ качестве Ђметодическихї генов используют обычно два - ген резистентности к неомицину neor и ген вирусной тимидинкиназы из вируса простого герпеса HSV-tk. ≈сли в некой клетке есть ген neor, то така€ клетка способна жить в присутствии препарата - аналога неомицина G418.  летки, не имеющие гена neor, погибают в присутствии G418. ≈сли в клетке есть вирусный ген HSV-tk, то така€ клетка погибнет при добавлении в среду культивировани€ противовирусного препарата ганцикловира.  леткам, не имеющим гена HSV-tk, ганцикловир не страшен.

 

—начала в ƒЌ  препарата заданного гена (т.е. in vitro), примерно в середину последовательности, встраивают ген neor. —боку на некотором рассто€нии помещают ген HSV-tk. Ёто и есть экзогенетическа€ конструкци€, необходима€ и достаточна€ дл€ попытки направленного мутагенеза в какой-либо клетке. ƒл€ Ђсоздани€ї целой мыши без заданного гена используют клетки линии ES. ¬ них трансфицируют описанную выше генетическую конструкцию, клетки помещают в селективную культуральную среду, содержащую G418 и ганцикловир.

¬озможны 3 варианта внутриклеточной Ђсудьбыї экзогенетической конструкции:

1) она не встраиваетс€ в хромосомы и бесследно тер€етс€ при делении клетки; такие клетки, просто ES, погибают в селективной среде от отравлени€ препаратом G418;

2) экзогенетическа€ конструкци€ встраиваетс€ на случайные места в геноме; она, как правило, сохран€ет свою целостность, несет и ген neor, и ген HSV-tk; такие клетки тоже погибают в селективной среде, но под действием ганцикловира;

3) экзогенетическа€ конструкци€ находит гомологичный клеточный ген и вступает с ним в гомологичную рекомбинацию: эти клетки и есть искомые; Ђхвостї с геном HSV-tk (он вне гомологичной области) выщепл€етс€ и тер€етс€ при делении клетки; ген neor, поскольку он расположен в середине гомологичной последовательности ƒЌ , как раз оказываетс€ встроенным в хромосому; в результате искомые клетки несут ген neor, но не несут ген HSV-tk и поэтому способны жить и делитьс€ в селективной среде, содержащей и G418, и ганцикловир; такие клетки и выдел€ют из массы остальных.

¬ описанном варианте направленный мутагенез, или нокаут гена, произошел на одной из гомологичных хромосом. ≈го можно выполнить и на обеих гомологичных хромосомах, дл€ чего нужны еще два других Ђметодическихї гена дл€ селекции. Ќо мышей с нокаутом гена можно получить и в случае нокаута одного из гомологичных генов в клетках ES следующим образом. ќт Ђсвежезабеременевшейї мыши выдел€ют эмбрионы на стадии бластулы или морулы (или провод€т оплодотворение in vitro). ¬ эти ранние эмбрионы инъецируют одномутированные клетки ES и имплантируют их в матку подготовленной псевдобеременной самке. »з такой сконструированной бластулы развиваютс€ здоровые (по мышиным меркам) эмбрионы, рождаютс€ мышата-мозаики, часть клеток которых во всех ткан€х, включа€ половые клетки, происходит из одномутированных клеток ES. ѕоскольку половые клетки гаплоидны, то часть из них несет в Ђчистом видеї нокаутированный ген.

 

ѕодобных мышат используют дл€ инбредного размножени€, и в потомстве второго поколени€ кака€-то часть мышат об€зательно получаетс€ гомозиготной по нокаутированному (испорченному) гену. Ёто и есть конечна€ цель работы. „тобы удостоверитьс€ в правильности полученного результата, выполн€ют контрольную ѕ÷– на ген neor.

“аких мышей размножают инбридингом и получают необходимое и достаточное дл€ запланированной работы число особей с заданным генетическим нокаутом (т.е. с отсутствием функционально дееспособного гена).

√енетический нокаут возможен только в отношении генов, отсутствие которых позвол€ет организму развитьс€, родитьс€ и начать жить. ≈сли какой-то ген абсолютно необходим дл€ реализации онтогенеза организма, то нокаут по данному гену осуществим в перевиваемых in vitro клетках, и в какой-то мере на модел€х in vitro исследуемы последстви€ отсутстви€ гена дл€ жизнеде€тельности клетки.

¬ышеперечисленным потенциал метода не исчерпываетс€. ћожно получить библиотеку экзогенов, в которых Ђметодическийї ген (а именно его внедрение и нарушает генетический код, т.е. €вл€етс€ мутирующим фактором) повреждает разные участки исследуемого гена. ќдним из генов библиотеки производ€т нокаут. «атем в отдельные Ђнокаутированныеї клетки трансфицируют интактный ген (если происходит реставраци€ экспрессии соответствующего белка, то она доказывает Ђот противногої: исходно сделанный нокаут был истин-

ным), а также (по одному) разные гены из библиотеки поврежденных генов. јнализируют, не произойдет ли реставраци€ экспрессии продукта в случае ретрансфекции каких-то генов из поврежденных. “аким образом, удаетс€ установить функциональную нагрузку различных участков одного гена.

—ущественные усовершенствовани€ в методы генетического нокаута внесли работы B. Sauer (1993), N.J. Kilby и соавт. (1993), H. Gu и K. Rajewsky (1993) и других исследователей, первыми использовавших сайтспецифичную рекомбиназу Cre (C auses re combination), выделенную Sauer из бактериофага –1. ≈сли в геном мыши ввести ранее описанным методом Ђслеваї и Ђсправаї от интересующего гена сайты, специфичные дл€ Cre, то вырезание гена (точнее, его инверсию и как следствие потерю функции) можно осуществить не в клетках ES, а в любой момент онтогенеза, т.е. у мышей в любом возрасте. ѕоследовательность нуклеотидов, узнаваема€ Cre, носит название LoxP (locus of X-over P1) и состоит из 34 пар оснований, включающих 13 пар инвертированных повторов по кра€м: ATAACTTGGTATAGCATACAT-TATACGAAGTTAT.

 

—истему ЂLoxP-Creї используют и в модели трансгенных мышей. “аким образом, существуют способы тканеспецифичного выключени€ заданного гена в заданный момент онтогенеза. Ёто весьма трудоемкие работы, но их познавательна€ ценность сегодн€ кажетс€ огромной.

“рансгенна€ мышь есть мышь, в чей геном введен посторонний ген (экзоген). „тобы Ђсделатьї трансгенную мышь, необходимо иметь в качестве препарата чистую ƒЌ , строго воспроизвод€щую последовательность нуклеотидов заданного экзогена (как минимум). ќбычно к ƒЌ  экзогена с определенным смыслом пристраивают еще регул€торные последовательности ƒЌ -промоторы и энхансеры. ѕолучают вектор экспрессии в виде кольцевой ƒЌ  (фактически - искусственный вирус).

Ђ√отов€тї мышь-самку: ей ввод€т фолликулостимулирующий гормон и хорионический гонадотропин дл€ индукции суперовул€ции. “акую самку спаривают с самцом, после чего у самки быстро извлекают оплодотворенные €йцеклетки. ћикроманипул€тором в мужской пронуклеус инъецируют ƒЌ  экзогена в дозе несколько сот копий, и такие €йцеклетки имплантируют в матку или €йцеводы другой подготовленной псевдобеременной самки. » ждут от нее потомства. ќпыт показывает, что примерно 25% новорожденных мышат несут

экзоген (теперь уже трансген) в своем геноме. Ёкзогены ковалентно встраиваютс€ (интегрируютс€) в одно или в несколько дес€тков мест собственного генома мыши (кстати, как ретровирусы типа ¬»„). ≈сли в собственном геноме нет генов, гомологичных экзогену, то встраивание экзогена происходит в случайные места генома.

¬страивание осуществл€етс€ очень быстро после ввода экзогенной ƒЌ  в пронуклеус - до первой репликации ƒЌ  зиготы, так как большинство мышей, получивших экзоген (75%), имеют его в каждой клетке своего тела, включа€ гаметы. »нтересно, но факт: встраивание чужеродной ƒЌ  в геном в большинстве случаев допускает нормальное развитие и рождение организма, разумеетс€, если трансген не кодирует синтез токсичного дл€ организма белка. ¬ первом поколении мышей трансген находитс€ в гетерозиготном состо€нии. “аких мышей спаривают, и во втором поколении отбирают гомозигот по трансгену. ¬от они уже и есть полноценные трансгенные мыши.

 

ƒополнение трансгена тканеспецифичными и/или индуцибельными промоторами позвол€ет манипулировать экспрессией трансгена по усмотрению экспериментатора (не во всех клетках; а только, например, в “-лимфоцитах или только в β-клетках островков Ћангерганса, не посто€нно, а только после введени€ в организм индуктора). “аким образом, можно изучать как будут проходить развитие и жизнеде€тельность организма при излишней экспрессии определенного гена (overexpression).



<== предыдуща€ лекци€ | следующа€ лекци€ ==>
»сследование экспрессии генов методом микрочипов | ѕрименение регул€торных микро-рнк в иммунологических исследовани€х
ѕоделитьс€ с друзь€ми:


ƒата добавлени€: 2015-02-12; ћы поможем в написании ваших работ!; просмотров: 423 | Ќарушение авторских прав


ѕоиск на сайте:

Ћучшие изречени€:

—тремитесь не к успеху, а к ценност€м, которые он дает © јльберт Ёйнштейн
==> читать все изречени€...

497 - | 507 -


© 2015-2023 lektsii.org -  онтакты - ѕоследнее добавление

√ен: 0.012 с.