Ћекции.ќрг


ѕоиск:




 атегории:

јстрономи€
Ѕиологи€
√еографи€
ƒругие €зыки
»нтернет
»нформатика
»стори€
 ультура
Ћитература
Ћогика
ћатематика
ћедицина
ћеханика
ќхрана труда
ѕедагогика
ѕолитика
ѕраво
ѕсихологи€
–елиги€
–иторика
—оциологи€
—порт
—троительство
“ехнологи€
“ранспорт
‘изика
‘илософи€
‘инансы
’ими€
Ёкологи€
Ёкономика
Ёлектроника

 

 

 

 


ќпределение ћ»‘-активности

ќпределение биологической активности ћ»‘ провод€т с помощью устройства дл€ формировани€ клеточных микрокультур (рис. 7.7) - ћ»√–ќ— –»Ќ (Ќ»» эпидемиологии и микробиологии им. Ќ.‘. √амалеи –јћЌ).

1. ¬ лунки 96-луночного планшета (Flow, ¬еликобритани€ или аналогичные) добавл€ют по 100 мкл разведенной на культуральной среде пробы, в которой определ€ют ћ»‘-активность (каждое разведение в 4 параллел€х, опытные пробы).  ультуральна€ среда включает RPMI 1640, 2 mM L-глутамина, 5% сыворотки эмбриона коровы, 40 мкг/мл гентамицина.

 

2. ¬ контрольные лунки добавл€ют культуральную среду (в 4 параллел€х) по 100 мкл.

3. √отов€т клеточную суспензию перитонеальных макрофагов, дл€ чего 2 мышам-гибридам (—¬јх—57¬1/6)F1 внутрибрюшинно ввод€т по 10 мл раствора ’енкса с гепарином (10 ≈ƒ/мл), осторожно массируют брюшко в течение 2-3 мин. «атем животное забивают декапитацией, осторожно прокалывают брюшную стенку в области паха и через иглу шприцем отсасывают экссудат.  летки перитонеального экссудата дважды отмывают раствором ’енкса, центрифугиру€ их 10-15 мин при 200 g. «атем готов€т суспензию клеток с концентрацией 10±1 млн/мл среды RPMI 1640. ѕодсчет провод€т в камере √ор€ева.

4. —обирают систему ћ»√–ќ— –»Ќ, представл€ющую собой штатив дл€ направленной и стандартной фиксации наконечников с клеточными культурами в строго вертикальном положении на заданной высоте над центром лунки 96-луночного культурального планшета, а также включающую 92 наконечника дл€ автоматической пипетки фирмы ЂCostarї, USA (рис. 7.7).

¬ставл€ют ножки штатива в угловые лунки планшета.  леточную суспензию набирают автоматической пипеткой в наконечники - по 5 мкл в каждый, ополаскивают от избытка клеток однократным опусканием в среду и вставл€ют вертикально в гнезда штатива системы. «аполненный штатив с наконечниками выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч на строго горизонтальной поверхности. «а это врем€ происходит оседание клеток суспензии на дно лунок, где формируютс€ стандартные клеточные микрокультуры.

5. Ўтатив с наконечниками осторожно снимают с планшета. ѕланшет с микрокультурой клеток помещают в строго горизонтальном положении в —ќ2-инкубатор, где культивируют в течение 20 ч. ¬ ходе культивировани€ клетки мигрируют по дну лунки.

 

6.  оличественный учет результатов после инкубации провод€т на бинокул€рной лупе, визуально оценива€ размер колонии по шкале внутри окул€ра. ћикрокультуры имеют форму круга. «атем исследователи определ€ют среднее значение диаметра колоний по результатам измерени€ колоний в 4 опытных или контрольных лунках. ѕогрешность измерени€ равна ±1 мм.

»ндекс миграции (»ћ) рассчитывают по формуле:

ѕроба обладает ћ»‘-активностью, если значени€ »ћ равны

0,6±0,2.

«а условную единицу (≈ƒ) ћ»‘-активности принимают обратную величину, равную значению наибольшего разведени€ пробы (образца), при котором индекс миграции равен 0,6±0,2.

Ѕиологическую активность ‘≈O αоценивают по цитотоксическому его действию на линию трансформированных фибробластов L-929. ¬ качестве положительного контрол€ используют рекомбинантный ‘Ќќа, а в качестве отрицательного контрол€ - клетки в культуральной среде.

¬ычисл€ют цитотоксический индекс (÷»):

где a - количество живых клеток в контроле; b - количество живых клеток в опыте.

–ис. 7.7. —хема ћ»√–ќ— –»Ќ - устройства дл€ количественной оценки миграции клеточных культур

 летки окрашивают красителем (метиленовым синим), который включаетс€ только в погибшие клетки.

«а условную единицу активности ‘Ќќ принимают значение обратного разведени€ образца, необходимого дл€ получени€ 50% клеточной цитотоксичности. ”дельна€ активность образца - отношение активности в условных единицах на 1 мл к концентрации белка, содержащегос€ в образце.

¬нутриклеточное окрашивание цитокинов. »зменение соотношени€ клеток, продуцирующих различные цитокины, может отражать патогенез заболевани€ и служить критерием прогноза заболевани€ и оценки проводимой терапии.

ћетодом внутриклеточного окрашивани€ определ€ют экспрессию цитокина на уровне одной клетки. ѕроточна€ цитофлуориметри€ позвол€ет подсчитать количество клеток, экспрессирующих тот или иной цитокин.

 

ѕеречислим основные этапы определени€ внутриклеточных цитокинов.

Ќестимулированные клетки продуцируют небольшие количества цитокинов, которые, как правило, не депонируютс€, поэтому важным этапом оценки внутриклеточных цитокинов €вл€ютс€ стимул€ци€ лимфоцитов и блокада выхода этих продуктов из клеток.

¬ качестве индуктора цитокинов чаще всего используют активатор протеинкиназы — форбол-12-миристат-13-ацетат (‘ћј) в комбинации с ионофором кальци€ иономицином (»Ќ). ѕрименение такого сочетани€ вызывает синтез широкого спектра цитокинов: »‘Ќу, »Ћ-4, »Ћ-2, ‘Ќќα. Ќедостаток использовани€ ‘ћј-»Ќ - проблемы вы€влени€ CD4-молекул на поверхности лимфоцитов после такой активации. “акже продукцию цитокинов “-лимфоцитами индуцируют с помощью митогенов (‘√ј). ¬-клетки и моноциты стимулируют

Ћѕ—.

ћононуклеарные клетки инкубируют в присутствии индукторов продукции цитокинов и блокатора их внутриклеточного транспорта брефельдина ј или моненсина в течение 2-6 ч.

«атем клетки ресуспендируют в буферном растворе. ƒл€ фиксации добавл€ют 2% формальдегид, инкубируют 10-15 мин при комнатной температуре.

ѕотом клетки обрабатывают сапонином, который повышает проницаемость клеточной мембраны, и окрашивают моноклональными антителами, специфичными к определ€емым цитокинам. ѕредварительное окрашивание поверхностных маркеров (CD4, CD8) увеличивает количество получаемой информации о клетке и позвол€ет более точно определить ее попул€ционную принадлежность.

»меютс€ некоторые ограничени€ в применении описанных выше методов. “ак, с их помощью невозможно анализировать синтез цитокинов единичной клеткой, невозможно определить количество цитокинпродуцирующих клеток в субпопул€ции, невозможно определить, экспрессируют ли цитокинпродуцирующие клетки уникальные маркеры, синтезируютс€ ли различные цитокины разными клетками или одними и теми же. ќтвет на эти вопросы получают, использу€ другие методы исследовани€. ƒл€ определени€ частоты цитокин-продуцирующих клеток в попул€ции примен€ют метод лимитирующих разведений и вариант иммуноферментного анализа ELISPOT (см. гл. 4).

 

ћетод гибридизации in situ. ћетод включает:

1) замораживание органа и приготовление криостатных срезов;

2) фиксацию параформальдегидом;

3) вы€вление м–Ќ  с помощью меченой кƒЌ . ¬ некоторых случа€х цитокиновую м–Ќ  определ€ют на срезах с помощью радиоизотопной ѕ÷–.

»ммунофлюоресценци€. ћетод включает:

1) замораживание органа и приготовление криостатных срезов;

2) фиксацию;

3) обработку срезов меченными флюоресцеином антицитокиновыми антителами;

4) изуальное наблюдение флюоресценции.

Ёти методики (гибридизаци€ in situ и иммунофлюоресценци€) быстры и не завис€т от пороговых концентраций секретируемого продукта. ќднако они не определ€ют количество секретированного цитокина и могут быть сложны технически. Ќеобходим разнообразный тщательный контроль на неспецифические реакции.

— помощью представленных методов оценки цитокинов были вы€влены патологические процессы, св€занные с нарушени€ми в системе цитокинов на различных уровн€х.

“аким образом, оценка системы цитокинов чрезвычайно важна дл€ характеристики состо€ни€ иммунной системы организма. »зучение различных уровней системы цитокинов позвол€ет получить информацию о функциональной активности разных типов иммунокомпетентных клеток, о т€жести воспалительного процесса, о его переходе на системный уровень и о прогнозе заболевани€.

¬опросы и задани€

1. ѕеречислите общие свойства цитокинов.

2. ѕриведите классификацию цитокинов.

3. ѕеречислите основные компоненты системы цитокинов.

4. ѕеречислите клетки-продуценты цитокинов.

5. ќхарактеризуйте семейства рецепторов цитокинов.

6.  аковы механизмы функционировани€ сети цитокинов?

7. –асскажите о выработке цитокинов в системе врожденного иммунитета.

8.  аковы основные подходы к комплексной оценке системы цитокинов?

9.  аковы методы тестировани€ цитокинов в биологических жидкост€х организма?

 

10.  аковы дефекты в системе цитокинов при различных патологи€х?

11.  аковы основные методы биологического тестировани€ »Ћ-1, »‘Ќ, ћ»‘, ‘Ќќа в биологических жидкост€х?

12. ќпишите процесс определени€ внутриклеточного содержани€ цитокинов.

13. ќпишите процесс определени€ цитокинов, секретируемых единичной клеткой.

14. ќпишите последовательность примен€емых методов вы€влени€ дефекта на уровне рецептора цитокина.

15. ќпишите последовательность методов, примен€емых дл€ вы€влени€ дефекта на уровне клеток-продуцентов цитокинов.

16.  акую информацию можно получить, исследу€ выработку цитокинов в культуре мононуклеарных клеток, в сыворотке крови?

 


 

Ћитература

1. √алактионов ¬.√. √рафические модели в иммунологии. - ћ.: ћедицина, 1986. - —. 236.

2. √орбунова ¬.Ќ., Ѕаранов ¬.—. ¬ведение в молекул€рную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний. - —ѕб: —пециальна€ литература, 1997. - —. 286.

3. ≈ршов ‘.». —истема интерферона в норме и при патологии. - ћ., ћедицина, 1996.

4. »гнатьева √.ј.,  овальчук Ћ.¬., —околова ≈.¬., √анковска€ Ћ.¬. и др. ћетодические указани€ к практическим зан€ти€м по иммуноана-

лизам. - ћ., 2006. - —. 56.

5.  етлинский —.ј., —имбирцев ј.—. ÷итокины. - —ѕб: ‘ќЋ»јЌ,

2008. - —. 550.

6.  лаус ƒ. Ћимфоциты. ћетоды. - ћ.: ћир, 1990. - —. 393.

7.  овальчук Ћ.¬., √анковска€ Ћ.¬., ’орева ћ.¬., —околова ≈.¬. —истема цитокинов, комплемента и современные методы иммунного анализа. - ћ., 2001. - —. 158.

8.  овальчук Ћ.¬., „ередеев „.ј. »ммунорегул€торна€ роль моноцитов в норме и при иммунопатологии / »тоги науки и техн. ¬»Ќ»“». —ер. »ммунологи€. - ћ., 1991. - “. 27. - —. 101-114.

9.  ондратьева ».ј., ярилин ј.ј. ѕрактикум по иммунологии. - ћ.: Academa, 2004. - —. 272.

10. Ћьвов ƒ. . ћедицинска€ вирусологи€. - ћ.: ћ»ј, 2008. -

—. 655.

11. ћасленникова ј.Ѕ. ћолекул€рно-биологические технологии в медицинской практике. - Ќовосибирск: јльфа ¬иста, 2006. -

—. 208.

12. ћакаров ќ.¬.,  овальчук Ћ.¬., √анковска€ Ћ.¬. и др. Ќевынашивание беременности, инфекци€, врожденный иммунитет. - ћ.: √Ёќ“ј–-

ћедиа, 2007. - —. 175.

13. ѕетров –.¬. »ммунологи€. - ћ.: ћедицина, 1987. - —. 414.

14. —ибир€к —.¬., „ерешнев ј.ј., —имбирцев ј.—. и др. ÷итокинова€ регул€ци€ биотрансформации ксенобиотиков и эндогенных

соединений. - ”рќ –јЌ, 2006. - —. 163.

15. ‘едосеева ¬.»., ѕор€дин √.¬.,  овальчук Ћ.¬., „ередеев ј.Ќ.,  оган ¬.ё. –уководство по иммунологическим и аллергическим методам в гигиенических исследовани€х. - ћ.: ѕ–ќћ≈ƒЁ , 1993. -

—. 320.

16. ’аитов –.ћ., »гнатьева “.ј., —идорович ».√. »ммунологи€. - ћ.: ћедицина, 2000. - —. 430.

17. ’ерингтон —., ћакги ƒж. ћолекул€рна€ клиническа€ диагностика. ћетоды // ћетод представл€ет собой следующее. - ћ.: ћир, 1999. - —. 558.

18. ярилин ј.ј. ќсновы иммунологии. - ћ.: ћедицина, 1999. -

—. 607.

19. Brown T.A. Gen cloning and DNA analysis / Blackwell Publishing. -

2002. - —. 363.

20. Carthew R.W Curr Opin. Gene regulation by microRNAs / Genet. - 2006, Dev. - Vol. 16. - –. 203-208.

21. Lindsay M.A. MicroRNAs and the immune response / Trends in I4.3.

 



<== предыдуща€ лекци€ | следующа€ лекци€ ==>
ќпределение активности интерферона | ќсновные направлени€
ѕоделитьс€ с друзь€ми:


ƒата добавлени€: 2015-02-12; ћы поможем в написании ваших работ!; просмотров: 366 | Ќарушение авторских прав


ѕоиск на сайте:

Ћучшие изречени€:

≈сли вы думаете, что на что-то способны, вы правы; если думаете, что у вас ничего не получитс€ - вы тоже правы. © √енри ‘орд
==> читать все изречени€...

305 - | 320 -


© 2015-2023 lektsii.org -  онтакты - ѕоследнее добавление

√ен: 0.026 с.