Определение изоэлектрической точки белков

Белки, благодаря присутствию в их составе аминных и карбоксильных групп, существуют в растворах в виде заряженных частиц.

В зависимости от количества в белке аминных и карбоксильных групп его молекула в водном растворе приобретает положительный или отрицательный заряд. Большинство белков животного происхождения содержат в своем составе больше дикарбоновых аминокислот и поэтому они заряжаются отрицательно (белки-анионы). Некоторые белки содержат в своем составе значительные количества диаминокислот и поэтому заряжаются положительно (белки-катионы). Одноименный заряд молекул способствует взаимному отталкиванию частиц, что обеспечивает устойчивость их в водном растворе.

Число ионизированных групп в белке может быть увеличено или уменьшено при изменении рН среды. В кислой среде подавляется диссоциация карбоксильных групп, и отрицательный суммарный заряд белковой молекулы уменьшается. Наоборот, в щелочной среде подавляется ионизация аминных групп, и положительный суммарный заряд белка уменьшается. При определенном значении рН число положительных зарядов на поверхности белковой молекулы будет равным числу отрицательных зарядов, и в целом заряд частицы белка станет равным нулю. Состояние белка, при котором суммарный заряд его равен нулю, называется изоэлектрическим состоянием. рН, при котором белок находится в изоэлектрическом состоянии, обозначается рl. В изоэлектрической точке за счет равенства зарядов ослабляются силы отталкивания между белковыми частицами, что благоприятствует агрегации белковых молекул и выпадению белка в осадок, т.е в изоэлектрической точке раствор белка неустойчив, белок теряет один из факторов стабилизации - заряд.

При добавлении щелочи или кислоты к белку, выпавшему в осадок в изоэлектрическом состоянии, наступает перезарядка его молекул, и белок вновь растворяется.

Принцип метода. В нескольких пробирках с помощью ацетатных буферов создают растворы с различными значениями рН среды. Затем во все пробирки добавляют гидрофильное соединение, отнимающее у белка гидратную оболочку, удерживающую его в растворе. По пробирке с наиболее обильным осадком белка определяют значение рН, соответствующее изоэлектрической точке.

Ход работы. Для определения изоэлектрической точки желатина в пять пробирок наливают растворы уксусной кислоты, уксуснокислого натрия, раствора желатина и этилового спирта в соотношениях, указанных в таблице 1. После перемешивания в каждой пробирке раствор имеет определенное значение рН и степень мутности. рН наиболее мутной смеси соответствует изоэлектрической точке желатина. Результаты опыта записывают в таблицу1.

В графике «степень мутности» отсутствие осадка обозначают знаком (-), наличие осадка – знаком (+), значительное помутнение – несколькими плюсами.

Таблица 1 - Основные параметры опыта и его результаты

Материалы и реактивы: 0,5%-ный раствор желатина; 0,1н раствор уксусной кислоты; 0,1н. раствор уксуснокислого натрия; 96%-ный этиловый спирт.

Оборудование: пробирки обыкновенные; мерные пипетки на 2 мл; цилиндры на 25 мл.