Методы исследования коагуляционного гемостаза значительно различаются по принципу исследования и возможностям визуальной и автоматизированной оценки результатов. Современная аппаратура для исследования свертывания крови основана, как правило, на 4 основных методах.
Турбидиметрический метод.
Образование фибрина под действием тромбина проявляется повышением мутности исследуемого образца, что детектируется фотометром.
Кинетический метод.
Конечный результат определяется по скорости изменения оптической плотности. Исследуемая плазма инкубируется с ферментом, и остаточная ферментативная активность определяется в реакции с хромогенными субстратами. Концентрация исследуемого вещества прямо или косвенно пропорциональна скорости гидролиза субстрата и выражается средним изменением плотности в минуту.
Метод конечной точки.
В этом методе гидролиз хромогенного субстрата останавливается уксусной кислотой. В момент такой остановки оптическая плотность пропорциональна концентрации исследуемого вещества и выражается в единицах экстинции.
Метод фиксированной оптической плотности.
Тромбин, участвуя в реакции гидролиза субстрата, обуславливает изменение цвета исследуемого образца. Результатом является время между началом исследования и моментом, когда оптическая плотность образца достигает 0,1 единицы оптической плотности.
Преаналитический этап исследований гемостаза.
Для исследования системы гемостаза в биохимических исследованиях используют плазму, получаемую из венозной крови.
Подготовка обследуемых:
· Забор крови делают утром с 8 до 10 часов и натощак.
· Исключить физическое перенапряжение и эмоциональное возбуждение (дать обследуемому 15 минут отдохнуть).
· Исключить курение и прием алкоголя непосредственно перед обследованием.
· Первые 5-6 капель выпускают на ватный тампон, т.к. они могут содержать тканевой тромбопластин.
· До центрифугирования пробирки ставят в ледяную баню (кроме исследования функции тромбоцитов).
· Интервал времени между забором крови и исследованием существенно сказывается на многих параметрах коагулограммы (1-3 часа), поэтому в результатах анализа указываю время забора крови и начала исследования.
· Пробирки лучше использовать стеклянные силиконированные (для уменьшения контактной активации гемостаза) или пластиковые.
· Если гематокритный показатель близок к нормальному (40 - 45 %), то соотношение крови и антикоагулянта должно составлять 9: 1. Если гематокрит не в норме, то соотношение расчитываю по формуле:
РX = Р (100 – Н): (595 – Н), мл.
Р – нужное количество крови.
Н – гематокритный показатель в %.
· Взятие крови целесообразно проводить не в одну пробирку, а дробно – в несколько пробирок с соответствующей расфосовкой антикоагулянта – стабилизатора.
· В качестве антикоагулянта используют 3,8 % раствор цитрата натрия или тринатрийцитрата, т.к. в цитратной крови (плазме) лучше сохраняются лабильные факторы свертывания крови и тромбоциты.
· Ацетилсалициловая кислота, нестероидные противовоспалительные средства, пенициллин, стрептокиназа, урокиназа увеличивают время кровотечения.
Получение биологического материала для гематологических исследований.
Получение стабилизированной крови.
В пробирку набирают антикоагулянт и кровь в рассчитанном соотношении. Немедленно перемешивают, не допуская образования воздушных пузырей. Ставят пробирку до центрифугирования в ледяную баню.
Получение плазмы крови богатой тромбоцитами (тромбоцитарная).
Стабилизированную кровь центрифугируют при 1000 – 1500 об/мин в течении 5-7 минут и собирают супернатант.
