Основано на оценке степени гемолиза в гипотонических растворах хлорида натрия, в которых происходит набухание и гемолиз эритроцитов. Выделяют 2 вида осмотической устойчивости эритроцитов: максимальная 0,28-0,32 % NaCl (разрушаются молодые эритроциты); минимальная 0,44-0,48 % NaCl (разрушаются старые эритроциты). Если границы сдвигаются в сторону максимальной устойчивости, то в периферической крови преобладают молодые эритроциты; если к минимальной устойчивости, то старые (кроветворение ослаблено).
ЦЕЛЬ: освоить методику определения осмотической устойчивости эритроцитов.
ОСНАЩЕНИЕ: дефибринированная кровь, штатив для пробирок, 10 пробирок, восковой карандаш, пипетка, стеклянная палочка, растворы хлорида натрия убывающей концентрации.
ХОД РАБОТЫ: предварительно готовят рабочие растворы натрия хлорида различной концентрации от 0,15 до 0,6%. Рабочие растворы натрия хлорида разливают по 5 мл в 10 центрифужных пробирок. В каждую добавляют по 3-5 капель дефибринированной крови. Пробирки оставляют на 1 час при комнатной температуре, а затем центрифугируют 5 мин при 2000 об/мин. Надосадочную жидкость из каждой пробирки исследуют на фотоэлектроколориметре. Определяют процент (степень) гемолиза, приняв за 100% гемолиз в пробирке с 0,15% раствором натрия хлорида. Гемолиз можно определять и визуально по цвету надосадочной жидкости. При его отсутствии наблюдается бесцветный раствор и большое количество осадка. При частичном гемолизе - появление окраски надосадочной жидкости (розовение) и уменьшение осадка. При полном гемолизе эритроцитов - интенсивная красно-лаковая окраска надосадочной жидкости и отсутствие осадка.
Частичный гемолиз характеризуется окрашиванием раствора и появлением осадка неразрушенных эритроцитов. Начало гемолиза (минимальная его степень) определяется по легкому порозовению (при визуальном определении гемолиза количество рабочего раствора в пробирке должно быть меньше 1,0 мл). Бесцветный раствор и большое количество осадка свидетельствуют об отсутствии гемолиза.
Определить, при какой концентрации раствора хлорида натрия наступает гемолиз и сделать вывод об осмотической устойчивости исследованных эритроцитов.
Е практическое занятие. Форменные элементы крови.
Физиологическая характеристика эритроцитов. Понятие об эритроцитозе и эритропении, анизоцитоз, пойкилоцитоз.
Гемоглобин, его виды и соединения, возрастные изменения, физиологическое значение. Цветовой показатель.
Физиологическая характеристика лейкоцитов. Лейкоцитарная формула и её клиническое значение. Понятие о лейкоцитозе и лейкопении. Изменение картины периферической крови при физических нагрузках.
Кроветворение, регуляция.
Методы подсчёта форменных элементов в камере Горяева.
Вопросы программированного контроля по теме занятия.
1. Сколько эритроцитов в одном литре крови: у мужчин, у женщин?
2. Какие функции выполняют эритроциты, что для них характерно?
3. Что такое эритроцитоз, эритропения?
4. Что характеризует кривая Прайс-Джонса? Что такое микроцитоз, макроцитоз,
анизоцитоз, пойкилоцитоз?
5. Какие методы используются для определения количества эритроцитов?
6. Какие из указанных величин соответствуют содержанию гемоглобина в крови женщин,
мужчин?
7. Что характерно для гемоглобина плода, новорожденного, взрослого?
8. Соединения гемоглобина.
9. Чему равен цветной показатель и о чём он говорит? Как определяется?
10. Какие функции выполняют лейкоциты? Сколько их в одном литре крови?
11. Что такое лейкоцитоз и лейкопения? Причины их вызывающие?
12. Какие лейкоциты относятся к гранулоцитам и к агранулоцитам?
13. Каковы функции базофилов, эозинофилов, нейтрофилов, моноцитов, лимфоцитов?
Каково их % содержание?
14. Как определяется лейкоцитарная формула? Причины её сдвига вправо, влево?
15. В каких случаях будет меняться соотношение зрелых и молодых нейтрофилов?
16. Что характерно для процесса кроветворения (гемопоэза), в каких органах он
протекает? Что характерно для костного мозга, его функции?
17. Какие факторы поддерживают эритроцитарное равновесие в организме?
18. Каковы свойства стволовой полипотентной клетки, частично детерминированной
клетки, унипотентной клетки?
19. Какие функции выполняет микрососудистый компонент короткоранговой регуляции
кроветворения?
20. Какие факторы могут принимать участие в специфической дальноранговой регуляции
гемопоэза?
21. Какие факторы участвуют в неспецифической регуляции гемопоэза?
Практические работы.
Счётная камера Горяева представляет собой толстую стеклянную пластину (предметное стекло) с углублением в центре, равным 1/10 мм. На дне камеры нанесены две сетки Горяева, разграниченные глубокой поперечной канавкой. Сбоку от сеток находятся стеклянные прямоугольные пластинки, к которым притирают специальные шлифовальные покровные стекла. Сетка Горяева представляет собой квадрат 3 х 3 мм, который разделен сверху и слева на 15 равных частей и состоит из 225 больших квадратов. Каждый третий ряд как сверху, так и слева разделен еще на 4 части и таким образом на пересечении образуются квадраты, разделенные на 16 малых. Большие квадраты, рассеченные вертикально и горизонтально на 16 малых квадратов чередуются с квадратами, разделенными только вертикальными или горизонтальными линиями; и квадратами чистыми, без линий.
Счётная камера Горяева. Меланжеры.
а) – вид сверху; б) – вид сбоку; а – для эритроцитов
в) – сетка Горяева. б – для лейкоцитов
Сторона большого квадрата 1/5 мм; площадь большого квадрата 1/25 мм2; глубина камеры равна 1/10 мм; объем большого квадрата 1/250 мм3.
Сторона малого квадрата 1/20 мм; площадь малого квадрата 1/400 мм2; глубина камеры равна 1/10 мм; объем малого квадрата 1/4000 мм3.
Для исключения ошибок подсчёта форменных элементов, связанных с их нахождением на границах квадратов, применяют правило Егорова: клетки считают внутри квадрата и на его верхней и левой границах.
1. Подсчёт эритроцитов в камере Горяева.
Камера Горяева должна быть сухой и чистой. К ней притирают покровное стекло до появления радужных полос (только при этих условиях соблюдается правильный объем камеры). Смеситель (меланжер) также должен быть чистым и обязательно сухим, на его короткий капилляр надевают резиновую трубку с грушей. В меланжер для эритроцитов (красная палочка в шарообразном расширении) до нижней метки "0,5" набирают кровь, погрузив в нее кончик смесителя; затем до метки "101" за шарообразным расширением 3% гипертонический раствор, в котором эритроциты сморщиваются - кровь разводится в 200 раз. Кровь набирают строго до метки, но если получилось больше, необходимо выпустить на ватку или фильтровальную бумагу. Закончив набор жидкости, переведите смеситель (меланжер) в горизонтальное положение, снимите резиновую трубку, закройте капилляр с обеих сторон большим и указательным пальцами и тщательно перемешайте кровь с жидкостью в расширении смесителя, встряхивая его. Кровь готова для подсчета эритроцитов. Полученной смесью заполняют счетную камеру Горяева. После заполнения камеры оставьте на 1-2 минуты в покое для оседания форменных элементов, приступайте к подсчету при малом увеличении микроскопа в затемненном поле зрения (диафрагма прикрыта и несколько опущен конденсор). Эритроциты считают в 5 больших (5 * 16 = 80 малых) квадратах. Подсчёт производят по формуле: Э = А*4000*200*10^6/80
где Э - количество эритроцитов в 1 л крови; А - сумма эритроцитов в 5-ти больших квадратах (80-ти малых); 4000 - множитель, приводящий к объёму крови 1 мкл (объём малого квадрата 1/4000 мкл); 200 - разведение крови (кровь в меланжере разводится в 200 раз); 80 - число малых квадратов; 10^6 - количество мкл в одном литре. Количество эритроцитов в норме: у женщин 3,9-4,7 10^12 /л; у мужчин 4-5 10^12 /л.
Произведите подсчёт количества эритроцитов в 1 л крови, сделайте заключение о соответствии полученных результатов нормативным.
