Тема 16. 1. Возбудители чумы, туляремии, бруцеллеза, сибирской язвы, лептоспироза и других зоонозных инфекций

▲ План

▲ Программа

 

1. Биологические свойства возбудителей зооантропоноз-ных инфекций, их патогенность, экология, особен­ность инфекций и эпидемиология вызываемых забо­леваний.

2. Микробиологическая диагностика чумы, туляремии, бруцеллеза, сибирской язвы, лептоспироза.

3. Особенности лабораторной работы с возбудителями

оои.

4. Диагностические, профилактические и лечебные пре­
параты.

▲ Демонстрация

1. Мазки из чистых культур: Brucella abortus, Bacillus ап-thracis, Francisella tularensis (окраска по методу Грама).

2. Yersinia pestis в гное из бубона (окраска метиленовым синим).

3. Культура лептоспиры в темном поле.

4. Рост B.anthracoides на питательной среде.

5. Реакция агглютинации Райта для серодиагностики бруцеллеза.

6. Реакция агглютинации для серодиагностики туляре­мии.

7. Диагностические, профилактические и лечебные пре­параты.

А Задание студентам

1. Микроскопировать и зарисовать препараты возбуди­телей зоонозных инфекций.

2. Учесть результаты реакции агглютинации Райта для серодиагностики бруцеллеза.

 

3. Проанализировать результаты РИГА для серодиагнос­тики бруцеллеза.

4. Оценить результаты реакции агглютинации с парными сыворотками больного для серодиагностики туляре­мии.

5. Оценить результаты реакции термокольцепреципита-ции по Асколи с исследуемым материалом (термоэк­стракт из шкуры животного).

6. Отметить результаты реакции агглютинации-лизиса лептоспир для серодиагностики лептоспироза и сде­лать заключение.

7. Ознакомиться с диагностическими, профилактичес­кими и лечебными препаратами.

А Методические указания

• Микробиологическая диагностика чумы

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: гной из бубонов, пунктат лимфатических узлов, мокрота, промывные воды же­лудка, кровь, патолого-анатомический материал.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование (схема 16.1.1). Из ис­следуемого материала готовят мазки, окрашивают по методу Грама и водным раствором метиленового синего. Y.pestis пред­ставляют собой грамотрицательные палочки овоидной формы (0,5x1,7 мкм). В мазках, окрашенных метиленовым синим, хорошо заметно биполярное распределение краски (рис. 16.1.1; на вклейке). Встречаются полиморфные клетки.

Бактериологическое исследование. Исследуемый материал за­севают на чашки с питательным агаром. Посевы инкубируют при 25—28 "С. Первичное изучение посевов производят через 10—12 ч. К этому сроку появляются колонии в виде батисто­вого платочка, которые образованы вирулентными R-формами. Мало- и авирулентные бактерии формируют S-формы коло­ний. Идентификацию чистой культуры проводят по морфоло­гии бактериальных клеток, характеру роста, антигенным и био­химическим свойствам, чувствительности к специфическому фагу и с помощью молекулярно-биологических методов. Иног­да также используют биопробу.

На бульоне Y.pestis образуют пленку со спускающимися ни­тями, напоминающими сталактиты; ферментируют многие са­хара до кислоты, индола не образуют, желатин не разжижают. Y.pestis содержат групповой термостабильный соматический антиген и специфический термолабильный капсульный анти­ген, который обнаруживается только у вирулентных штаммов. В случае исследования материала, взятого у погибших грызу­нов, проводят дифференциальную диагностику с возбудителя­ми псевдотуберкулеза (Yersinia pseudotuberculosis) на основании

характера роста на специальных средах, биохимических свойств (ферментация рамнозы, адонита) и других признаков.

Биопроба. Проводят для выделения чистой культуры из ма­териала, загрязненного посторонней микрофлорой. Наиболее чувствительными лабораторными животными являются мор­ские свинки. Материал вводят подкожно или внутрибрюшинно в том случае, если он не загрязнен другими бактериями. При контаминации посторонней микрофлорой материал втирают морской свинке в выбритый участок кожи в области живота. После гибели животных (на 3—7-й день в зависимости от способа введения материала) делают вскрытие, отмечают па­тологические изменения органов и проводят бактериологичес­кое исследование по схеме 16.1.1.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохими­ческие и молекулярно-биологические исследования. Иммуно­химические исследования. Иммунофлюоресцентный метод позволяет обнаружить присутствие антигенов возбудите­ля как в патологическом материале, так и в объектах окружаю­щей среды (вода, почва), а также в пищевых продуктах и эктопаразитах. С этой целью используют люминесцентную ви-доспецифическую противочумную сыворотку, люминесцент­ные противокапсульную и противосоматическую сыворотки. РИГА применяют для обнаружения антигенов возбудителя чу­мы в исследуемом материале с помощью стандартной проти­вочумной сыворотки, антитела которой нагружены на эритро­циты.

Биохимические и молекулярно-биологичес­кие исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбу­дителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствую­щих молекул можно поставить предварительный диагноз.

• Микробиологическая диагностика туляремии

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: гной из бубонов, пунктат лимфатических узлов, мокрота, кровь, патолого-ана-томический материал.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование (схема 16.1.2). Из иссле­дуемого материала готовят мазки, окрашивают по методу Грама и метиленовым синим. Для F.tularensis характерен выраженный полиморфизм. В чистой культуре они представляют собой очень мелкие (0,3—0,5 мкм) кокки (рис. 16.1.2; на вклейке). В мазках из органов преобладают палочковидные формы. Спор не образуют, грамотрицательны, иногда выражена биполярная окраска. В биоптатах тканей и мазках F.tularensis могут распо­лагаться как вне, так и внутри клеток. Бактерии слабо окра­шиваются по методу Грама и плохо выявляются в материале

при обычных методах микроскопии. Для обнаружения использу­ют преимущественно метод иммунофлюоресценции (см. ниже).

Бактериологическое исследование. Применяют для выделе­ния чистой культуры F.tularensis. Бактериологическую диагнос­тику осуществляют в специальных лабораториях. Выделение возбудителя проводят на свернутой яично-желточной среде, глюкозоцистиновом кровяном агаре и других богатых пита­тельных средах сложного состава. Для подавления роста сопут­ствующей микрофлоры в среды добавляют пенициллин. Виру­лентные штаммы образуют S-формы колоний — мелкие, глад­кие, беловатого цвета с голубоватым оттенком. Идентифи­кацию чистой культуры проводят по морфологии бактериаль­ных клеток, характеру роста, биохимическим, антигенным свойствам и с помощью молекулярно-биологических методов. Биохимические свойства F.tularensis выявляют на специальной плотной среде с ограниченным содержанием белка. Бактерии содержат оболочечный антиген, с которым связаны их виру­лентные и иммуногенные свойства, и О-соматический антиген. По антигенным свойствам близки к бруцеллам.

Биопроба. Наиболее чувствительными животными являются белые мыши и морские свинки, которые погибают при под­кожном введении единичных бактерий.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохими­ческие и молекулярно-биологические исследования. Иммуно­химические исследования. Метод ИФ позволяет обна­ружить присутствие антигенов бактерий в патологическом ма­териале. Используют люминесцентную противотуляремийную сыворотку. В положительном случае в препарате видны светя­щиеся микроорганизмы. Антигены возбудителя в материале от больного могут быть обнаружены с помощью ИФА.

Биохимические и молекулярно-биологичес­кие исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбу­дителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствую­щих молекул можно поставить предварительный диагноз.

Серодиагностика. Ставят реакцию агглютинации с туляре-мийным диагностикумом. Относительно позднее появление антител-агглютининов в крови (на 2-й неделе болезни) затруд­няет применение этой реакции для ранней диагностики, одна­ко их длительное сохранение делает возможной ретроспектив­ную диагностику. Диагностический титр реакции 1:100. Обя­зательно прослеживается нарастание титра агглютинации (в парных сыворотках). Более чувствительным методом серодиаг­ностики туляремии является РИГА, которая бывает положи­тельной в конце 1-й — начале 2-й недели заболевания. Титры антител в сыворотке в разгар заболевания достигают 1:1280— 1:2560 и выше. Используют также ИФА.

Для ускоренной диагностики применяют кровяно-капель-

ную реакцию: кровь из пальца больного наносят на обезжи­ренное предметное стекло, добавляют каплю дистиллирован­ной воды (для лизиса эритроцитов), вносят каплю диагности-кума и смешивают стеклянной палочкой. При наличии в крови агглютининов в диагностическом титре (1:100 и выше) в капле немедленно наступает агглютинация диагностикума; при тит­рах ниже диагностических агглютинация происходит через 2—3 мин.

Кожно-аллергическая проба. Для диагностики применяют внутрикожную и накожную пробы со специфическим аллерге­ном — тулярином. Пробы высокочувствительны и дают поло­жительные результаты у больных начиная с 3—5-го дня болез­ни. Положительные результаты регистрируются также у пере­болевших и вакцинированных, поэтому оценка реакции должна проводиться с осторожностью.

• Микробиологическая диагностика бруцеллеза

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериологическое исследование (схема 16.1.3). Для получе­ния гемокультуры 5—10 мл крови, взятой из локтевой вены больного, засевают в два флакона с 50—100 мл печеночного бульона. Один из них (для выделения культуры B.melitensis) инкубируют в обычных аэробных условиях, другой (для выде­ления первичной культуры B.abortus) — в атмосфере с 10 % С0₂. В первых генерациях бруцеллы растут очень медленно, поэтому посевы выдерживают в термостате не менее месяца. В то же время рост лабораторных культур наблюдается через 1—2 сут. На агаре бруцеллы образуют бесцветные с перламут­ровым блеском колонии, в бульоне — помутнение и слизистый осадок. В мазках, окрашенных по методу Грама, обнаружива­ются мелкие (от 0,3—0,5 до 1,5 мкм) грамотрицательные кок-ковидные или более удлиненные формы (рис. 16.1.3; на вклей­ке). Они неподвижны, спор не образуют.

Для быстрой идентификации бруцелл ставят РА со специ­фическими агглютинирующими сыворотками на стекле и оп­ределяют чувствительность к специфическому фагу. Все виды бруцелл не ферментируют углеводы. Их дифференцируют по образованию H₂S, чувствительности к С0₂, способности окра­шиваться анилиновыми красителями (основным фуксином и тионином) и другим признакам. Используют также молекуляр-но-биологические методы.

Биопроба. Применяют для выделения чистой культуры из материала, загрязненного посторонней микрофлорой или со­держащего небольшое количество бруцелл. Исследуемый мате­риал вводят морским свинкам или белым мышам подкожно в паховую область. Мышей вскрывают через 20 дней после за-

ражения, морских свинок — через 30. Кусочки органов и лим­фатических узлов засевают на питательные среды для получе­ния чистой культуры и ее идентификации.

Экспресс-методы диагностики. Биохимические и моле-кулярно-биологические исследования. Исследуемый материал используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих моле­кул можно поставить предварительный диагноз.

Серодиагностика. Чаще всего используют реакцию агглюти­нации Райта с бруцеллезным диагностикумом. Реакция доста­точно специфична. Положительные результаты отмечаются спустя 1—2 нед после начала заболевания и сохраняются у переболевших многие годы. Диагностический титр реакции 1:200. Для ускоренной серодиагностики применяют реакцию агглютинации Хеддельсона, которую ставят с неразведенной сывороткой больного и концентрированным антигеном — диа­гностикумом, окрашенным метиленовым синим.

Обезжиренное квадратное стекло размером 9x12 см делят на 5 квадратов, в которые микропипеткой вносят ингредиенты, как указано в табл. 16.1.1. Капли смешивают палочкой, начи­ная с минимальной дозы сыворотки. Стекло осторожно подо­гревают над пламенем горелки примерно до 37 °С в течение 2 мин. При положительной реакции в первые минуты появля­ются хлопья синего цвета. Реакция положительна при наличии агглютинации на "++" в дозах сыворотки 0,02—0,01 мл.

Таблица 16.1.1. Постановка пластинчатой реакции агглютинации Хеддельсона

 

Ингредиент		Количество материала, мл
	квадрат 1	квадрат 2	квадрат 3	квадрат 4	квадрат 5
				контроль сыво­ротки	контроль диагнос- тикума
Сыворотка Диагностикум Изотонический раствор хлорида натрия	0,04 0,03	0,02 0,01 0,03 0,03	0,02 0,03	0,03 0,03

Кроме того, для серодиагностики бруцеллеза используют РИГА, реакцию непрямой ИФ, опсонофагоцитарную реакцию, РСК, метод определения неполных антител и реакцию Кумбса и др. Эти серологические реакции обладают достаточно высо­кой специфичностью и чувствительностью. В поздние периоды

заболевания процент положительных серологических реак­ций (РА, РИГА и РСК) начинает снижаться и большее диа­гностическое значение приобретают кожно-аллергическая проба и реакция Кумбса, поэтому комплексный серо-аллерги­ческий метод является наиболее надежным в диагностике бруцеллеза.

Кожно-аллергическая проба (реакция Бюрне). На ладонную поверхность предплечья внутрикожно вводят 0,1 мл бруцелли-на. При наличии ГЗТ уже через 6—8 ч могут появиться гипе­ремия кожи и болезненная отечность. Учет реакции производят через 24 ч (см. рис. 10.4.1). Реакция обладает высокой чувстви­тельностью и появляется не только у больных и переболевших, но и у вакцинированных людей, в связи с чем ее диагностическая оценка должна производиться с осторожностью.

• Микробиологическая диагностика сибирской язвы

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: экссудат из очага по­ражения (сибиреязвенного карбункула), мокрота, фекалии, кровь.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование (схема 16.1.4). Изучение окрашенных по методу Грама мазков из патологического ма­териала (экссудат, мокрота) позволяет обнаружить возбуди­теля, представляющего собой грамположительную крупную (1—2 х 6—10 мкм) неподвижную стрептобациллу. В организме больных и на белковой питательной среде микроорганизмы образуют капсулу (рис. 16.1.4; на вклейке), в неблагоприят­ных условиях (почве) — споры (см. рис. 2.2).

Бактериологическое исследование. Исследуемый материал за­севают на чашки с питательным и кровяным агаром, а также в пробирку с питательным бульоном. Посевы инкубируют при 37 "С в течение 18—20 ч. В бульоне культура B.anthracis растет в виде хлопьевидного осадка; на агаре вирулентные штаммы образуют колонии R-формы, имеющие под малым увеличени­ем микроскопа вид львиной гривы или головы медузы. Авиру-лентные или слабовирулентные бактерии образуют S-формы колоний.

Для идентификации возбудителя изучают биохимические свойства и ряд других признаков (гемолитическую активность, способность к образованию L-форм и др.). B.anthracis обладает сахаролитическими свойствами, медленно разжижает желатин (в виде елочки верхушкой вниз), лишен гемолитической ак­тивности. Под действием пенициллина образует сфероплас-ты, имеющие вид жемчужин. Это явление используется для дифференциации B.anthracis от непатогенных бацилл. При­меняют также молекулярно-биологические методы идентифи­кации.

 

Биопроба. Исследуемый материал вводят подкожно белым мышам, морским свинкам или кроликам. Павших животных вскрывают, готовят мазки из крови и внутренних органов, делают посевы для выделения чистой культуры возбудителя. Капсульные формы B.anthracis в экссудате, полученном через 5—18 ч после заражения животного, можно обнаружить мето­дом иммунофлюоресценции (см. ниже).

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохими­ческие и молекулярно-биологические исследования. Иммуно­химические исследования. Мазки из экссудата обраба­тывают противокапсульной сибиреязвенной антисывороткой, а затем флюоресцирующей антикроличьей сывороткой, мечен­ной родамином. В препаратах, содержащих капсульные бацил­лы, наблюдается желто-зеленое свечение возбудителя.

Антигены B.anthracis (секретируемые белки — "протектив-ный антиген" и токсины) в исследуемом материале из очага инфекции могут быть обнаружены с помощью чувствительных серологических реакций (ИФА и др.).

Реакцию термокольцепреципитации Асколи для исследова­ния трупного материала ставят при необходимости диагности­ровать сибирскую язву у павших животных или у людей, умер­ших от неизвестной болезни, напоминающей висцеральную форму сибирской язвы, а также для определения зараженности сырья (кожа, мех, шерсть). Образцы исследуемого материала измельчают и кипятят в пробирке с изотоническим раствором хлорида натрия в течение 5—10 мин, после чего фильтруют до полной прозрачности. Преципитирующую сибиреязвенную сы­воротку получают путем гипериммунизации лошадей убитой культурой B.anthracis. Испытуемый термоэкстракт осторожно наслаивают на поверхность сыворотки в преципитационной пробирке. В положительном случае через 1—2 мин в месте соприкосновения появляется белое кольцо преципитации, что свидетельствует о присутствии в материале антигенов возбуди­теля. Контрольный термоэкстракт готовят из того же материа­ла, взятого от здорового животного (см. табл. 10.1.1).

Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих моле­кул можно поставить предварительный диагноз.

Кожно-аллергическая проба. Ставится на внутренней поверх­ности предплечья — внутрикожно вводят 0,1 мл антраксина. При положительной реакции через 24 ч появляются гиперемия и инфильтрат. Положительная реакция регистрируется у 90 % больных сибирской язвой, начиная со 2-й недели заболевания, и сохраняется у переболевших в течение всей жизни, в связи с чем ее диагностическая оценка должна производиться с ос­торожностью.