Тема 16. 1. Возбудители чумы, туляремии, бруцеллеза, сибирской язвы, лептоспироза и других зоонозных инфекций

▲ План

▲ Программа

1. Биологические свойства возбудителей зооантропоноз-ных инфекций, их патогенность, экология, особенность инфекций и эпидемиология вызываемых заболеваний.

2. Микробиологическая диагностика чумы, туляремии, бруцеллеза, сибирской язвы, лептоспироза.

3. Особенности лабораторной работы с возбудителями

оои.

4. Диагностические, профилактические и лечебные пре
параты.

▲ Демонстрация

1. Мазки из чистых культур: Brucella abortus, Bacillus ап-thracis, Francisella tularensis (окраска по методу Грама).

2. Yersinia pestis в гное из бубона (окраска метиленовым синим).

3. Культура лептоспиры в темном поле.

4. Рост B.anthracoides на питательной среде.

5. Реакция агглютинации Райта для серодиагностики бруцеллеза.

6. Реакция агглютинации для серодиагностики туляремии.

7. Диагностические, профилактические и лечебные препараты.

А Задание студентам

1. Микроскопировать и зарисовать препараты возбудителей зоонозных инфекций.

2. Учесть результаты реакции агглютинации Райта для серодиагностики бруцеллеза.

3. Проанализировать результаты РИГА для серодиагностики бруцеллеза.

4. Оценить результаты реакции агглютинации с парными сыворотками больного для серодиагностики туляремии.

5. Оценить результаты реакции термокольцепреципита-ции по Асколи с исследуемым материалом (термоэкстракт из шкуры животного).

6. Отметить результаты реакции агглютинации-лизиса лептоспир для серодиагностики лептоспироза и сделать заключение.

7. Ознакомиться с диагностическими, профилактическими и лечебными препаратами.

А Методические указания

• Микробиологическая диагностика чумы

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: гной из бубонов, пунктат лимфатических узлов, мокрота, промывные воды желудка, кровь, патолого-анатомический материал.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование (схема 16.1.1). Из исследуемого материала готовят мазки, окрашивают по методу Грама и водным раствором метиленового синего. Y.pestis представляют собой грамотрицательные палочки овоидной формы (0,5x1,7 мкм). В мазках, окрашенных метиленовым синим, хорошо заметно биполярное распределение краски (рис. 16.1.1; на вклейке). Встречаются полиморфные клетки.

Бактериологическое исследование. Исследуемый материал засевают на чашки с питательным агаром. Посевы инкубируют при 25—28 "С. Первичное изучение посевов производят через 10—12 ч. К этому сроку появляются колонии в виде батистового платочка, которые образованы вирулентными R-формами. Мало- и авирулентные бактерии формируют S-формы колоний. Идентификацию чистой культуры проводят по морфологии бактериальных клеток, характеру роста, антигенным и биохимическим свойствам, чувствительности к специфическому фагу и с помощью молекулярно-биологических методов. Иногда также используют биопробу.

На бульоне Y.pestis образуют пленку со спускающимися нитями, напоминающими сталактиты; ферментируют многие сахара до кислоты, индола не образуют, желатин не разжижают. Y.pestis содержат групповой термостабильный соматический антиген и специфический термолабильный капсульный антиген, который обнаруживается только у вирулентных штаммов. В случае исследования материала, взятого у погибших грызунов, проводят дифференциальную диагностику с возбудителями псевдотуберкулеза (Yersinia pseudotuberculosis) на основании

характера роста на специальных средах, биохимических свойств (ферментация рамнозы, адонита) и других признаков.

Биопроба. Проводят для выделения чистой культуры из материала, загрязненного посторонней микрофлорой. Наиболее чувствительными лабораторными животными являются морские свинки. Материал вводят подкожно или внутрибрюшинно в том случае, если он не загрязнен другими бактериями. При контаминации посторонней микрофлорой материал втирают морской свинке в выбритый участок кожи в области живота. После гибели животных (на 3—7-й день в зависимости от способа введения материала) делают вскрытие, отмечают патологические изменения органов и проводят бактериологическое исследование по схеме 16.1.1.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохимические и молекулярно-биологические исследования. Иммунохимические исследования. Иммунофлюоресцентный метод позволяет обнаружить присутствие антигенов возбудителя как в патологическом материале, так и в объектах окружающей среды (вода, почва), а также в пищевых продуктах и эктопаразитах. С этой целью используют люминесцентную ви-доспецифическую противочумную сыворотку, люминесцентные противокапсульную и противосоматическую сыворотки. РИГА применяют для обнаружения антигенов возбудителя чумы в исследуемом материале с помощью стандартной противочумной сыворотки, антитела которой нагружены на эритроциты.

Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих молекул можно поставить предварительный диагноз.

• Микробиологическая диагностика туляремии

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: гной из бубонов, пунктат лимфатических узлов, мокрота, кровь, патолого-ана-томический материал.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование (схема 16.1.2). Из исследуемого материала готовят мазки, окрашивают по методу Грама и метиленовым синим. Для F.tularensis характерен выраженный полиморфизм. В чистой культуре они представляют собой очень мелкие (0,3—0,5 мкм) кокки (рис. 16.1.2; на вклейке). В мазках из органов преобладают палочковидные формы. Спор не образуют, грамотрицательны, иногда выражена биполярная окраска. В биоптатах тканей и мазках F.tularensis могут располагаться как вне, так и внутри клеток. Бактерии слабо окрашиваются по методу Грама и плохо выявляются в материале

при обычных методах микроскопии. Для обнаружения используют преимущественно метод иммунофлюоресценции (см. ниже).

Бактериологическое исследование. Применяют для выделения чистой культуры F.tularensis. Бактериологическую диагностику осуществляют в специальных лабораториях. Выделение возбудителя проводят на свернутой яично-желточной среде, глюкозоцистиновом кровяном агаре и других богатых питательных средах сложного состава. Для подавления роста сопутствующей микрофлоры в среды добавляют пенициллин. Вирулентные штаммы образуют S-формы колоний — мелкие, гладкие, беловатого цвета с голубоватым оттенком. Идентификацию чистой культуры проводят по морфологии бактериальных клеток, характеру роста, биохимическим, антигенным свойствам и с помощью молекулярно-биологических методов. Биохимические свойства F.tularensis выявляют на специальной плотной среде с ограниченным содержанием белка. Бактерии содержат оболочечный антиген, с которым связаны их вирулентные и иммуногенные свойства, и О-соматический антиген. По антигенным свойствам близки к бруцеллам.

Биопроба. Наиболее чувствительными животными являются белые мыши и морские свинки, которые погибают при подкожном введении единичных бактерий.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохимические и молекулярно-биологические исследования. Иммунохимические исследования. Метод ИФ позволяет обнаружить присутствие антигенов бактерий в патологическом материале. Используют люминесцентную противотуляремийную сыворотку. В положительном случае в препарате видны светящиеся микроорганизмы. Антигены возбудителя в материале от больного могут быть обнаружены с помощью ИФА.

Серодиагностика. Ставят реакцию агглютинации с туляре-мийным диагностикумом. Относительно позднее появление антител-агглютининов в крови (на 2-й неделе болезни) затрудняет применение этой реакции для ранней диагностики, однако их длительное сохранение делает возможной ретроспективную диагностику. Диагностический титр реакции 1:100. Обязательно прослеживается нарастание титра агглютинации (в парных сыворотках). Более чувствительным методом серодиагностики туляремии является РИГА, которая бывает положительной в конце 1-й — начале 2-й недели заболевания. Титры антител в сыворотке в разгар заболевания достигают 1:1280— 1:2560 и выше. Используют также ИФА.

Для ускоренной диагностики применяют кровяно-капель-

ную реакцию: кровь из пальца больного наносят на обезжиренное предметное стекло, добавляют каплю дистиллированной воды (для лизиса эритроцитов), вносят каплю диагности-кума и смешивают стеклянной палочкой. При наличии в крови агглютининов в диагностическом титре (1:100 и выше) в капле немедленно наступает агглютинация диагностикума; при титрах ниже диагностических агглютинация происходит через 2—3 мин.

Кожно-аллергическая проба. Для диагностики применяют внутрикожную и накожную пробы со специфическим аллергеном — тулярином. Пробы высокочувствительны и дают положительные результаты у больных начиная с 3—5-го дня болезни. Положительные результаты регистрируются также у переболевших и вакцинированных, поэтому оценка реакции должна проводиться с осторожностью.

• Микробиологическая диагностика бруцеллеза

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериологическое исследование (схема 16.1.3). Для получения гемокультуры 5—10 мл крови, взятой из локтевой вены больного, засевают в два флакона с 50—100 мл печеночного бульона. Один из них (для выделения культуры B.melitensis) инкубируют в обычных аэробных условиях, другой (для выделения первичной культуры B.abortus) — в атмосфере с 10 % С0₂. В первых генерациях бруцеллы растут очень медленно, поэтому посевы выдерживают в термостате не менее месяца. В то же время рост лабораторных культур наблюдается через 1—2 сут. На агаре бруцеллы образуют бесцветные с перламутровым блеском колонии, в бульоне — помутнение и слизистый осадок. В мазках, окрашенных по методу Грама, обнаруживаются мелкие (от 0,3—0,5 до 1,5 мкм) грамотрицательные кок-ковидные или более удлиненные формы (рис. 16.1.3; на вклейке). Они неподвижны, спор не образуют.

Для быстрой идентификации бруцелл ставят РА со специфическими агглютинирующими сыворотками на стекле и определяют чувствительность к специфическому фагу. Все виды бруцелл не ферментируют углеводы. Их дифференцируют по образованию H₂S, чувствительности к С0₂, способности окрашиваться анилиновыми красителями (основным фуксином и тионином) и другим признакам. Используют также молекуляр-но-биологические методы.

Биопроба. Применяют для выделения чистой культуры из материала, загрязненного посторонней микрофлорой или содержащего небольшое количество бруцелл. Исследуемый материал вводят морским свинкам или белым мышам подкожно в паховую область. Мышей вскрывают через 20 дней после за-

ражения, морских свинок — через 30. Кусочки органов и лимфатических узлов засевают на питательные среды для получения чистой культуры и ее идентификации.

Экспресс-методы диагностики. Биохимические и моле-кулярно-биологические исследования. Исследуемый материал используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих молекул можно поставить предварительный диагноз.

Серодиагностика. Чаще всего используют реакцию агглютинации Райта с бруцеллезным диагностикумом. Реакция достаточно специфична. Положительные результаты отмечаются спустя 1—2 нед после начала заболевания и сохраняются у переболевших многие годы. Диагностический титр реакции 1:200. Для ускоренной серодиагностики применяют реакцию агглютинации Хеддельсона, которую ставят с неразведенной сывороткой больного и концентрированным антигеном — диагностикумом, окрашенным метиленовым синим.

Обезжиренное квадратное стекло размером 9x12 см делят на 5 квадратов, в которые микропипеткой вносят ингредиенты, как указано в табл. 16.1.1. Капли смешивают палочкой, начиная с минимальной дозы сыворотки. Стекло осторожно подогревают над пламенем горелки примерно до 37 °С в течение 2 мин. При положительной реакции в первые минуты появляются хлопья синего цвета. Реакция положительна при наличии агглютинации на "++" в дозах сыворотки 0,02—0,01 мл.

Таблица 16.1.1. Постановка пластинчатой реакции агглютинации Хеддельсона

Ингредиент		Количество материала, мл
	квадрат 1	квадрат 2	квадрат 3	квадрат 4	квадрат 5
				контроль сыворотки	контроль диагнос- тикума
Сыворотка Диагностикум Изотонический раствор хлорида натрия	0,04 0,03	0,02 0,01 0,03 0,03	0,02 0,03	0,03 0,03

Кроме того, для серодиагностики бруцеллеза используют РИГА, реакцию непрямой ИФ, опсонофагоцитарную реакцию, РСК, метод определения неполных антител и реакцию Кумбса и др. Эти серологические реакции обладают достаточно высокой специфичностью и чувствительностью. В поздние периоды

заболевания процент положительных серологических реакций (РА, РИГА и РСК) начинает снижаться и большее диагностическое значение приобретают кожно-аллергическая проба и реакция Кумбса, поэтому комплексный серо-аллергический метод является наиболее надежным в диагностике бруцеллеза.

Кожно-аллергическая проба (реакция Бюрне). На ладонную поверхность предплечья внутрикожно вводят 0,1 мл бруцелли-на. При наличии ГЗТ уже через 6—8 ч могут появиться гиперемия кожи и болезненная отечность. Учет реакции производят через 24 ч (см. рис. 10.4.1). Реакция обладает высокой чувствительностью и появляется не только у больных и переболевших, но и у вакцинированных людей, в связи с чем ее диагностическая оценка должна производиться с осторожностью.

• Микробиологическая диагностика сибирской язвы

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: экссудат из очага поражения (сибиреязвенного карбункула), мокрота, фекалии, кровь.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование (схема 16.1.4). Изучение окрашенных по методу Грама мазков из патологического материала (экссудат, мокрота) позволяет обнаружить возбудителя, представляющего собой грамположительную крупную (1—2 х 6—10 мкм) неподвижную стрептобациллу. В организме больных и на белковой питательной среде микроорганизмы образуют капсулу (рис. 16.1.4; на вклейке), в неблагоприятных условиях (почве) — споры (см. рис. 2.2).

Бактериологическое исследование. Исследуемый материал засевают на чашки с питательным и кровяным агаром, а также в пробирку с питательным бульоном. Посевы инкубируют при 37 "С в течение 18—20 ч. В бульоне культура B.anthracis растет в виде хлопьевидного осадка; на агаре вирулентные штаммы образуют колонии R-формы, имеющие под малым увеличением микроскопа вид львиной гривы или головы медузы. Авиру-лентные или слабовирулентные бактерии образуют S-формы колоний.

Для идентификации возбудителя изучают биохимические свойства и ряд других признаков (гемолитическую активность, способность к образованию L-форм и др.). B.anthracis обладает сахаролитическими свойствами, медленно разжижает желатин (в виде елочки верхушкой вниз), лишен гемолитической активности. Под действием пенициллина образует сфероплас-ты, имеющие вид жемчужин. Это явление используется для дифференциации B.anthracis от непатогенных бацилл. Применяют также молекулярно-биологические методы идентификации.

Биопроба. Исследуемый материал вводят подкожно белым мышам, морским свинкам или кроликам. Павших животных вскрывают, готовят мазки из крови и внутренних органов, делают посевы для выделения чистой культуры возбудителя. Капсульные формы B.anthracis в экссудате, полученном через 5—18 ч после заражения животного, можно обнаружить методом иммунофлюоресценции (см. ниже).

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохимические и молекулярно-биологические исследования. Иммунохимические исследования. Мазки из экссудата обрабатывают противокапсульной сибиреязвенной антисывороткой, а затем флюоресцирующей антикроличьей сывороткой, меченной родамином. В препаратах, содержащих капсульные бациллы, наблюдается желто-зеленое свечение возбудителя.

Антигены B.anthracis (секретируемые белки — "протектив-ный антиген" и токсины) в исследуемом материале из очага инфекции могут быть обнаружены с помощью чувствительных серологических реакций (ИФА и др.).

Реакцию термокольцепреципитации Асколи для исследования трупного материала ставят при необходимости диагностировать сибирскую язву у павших животных или у людей, умерших от неизвестной болезни, напоминающей висцеральную форму сибирской язвы, а также для определения зараженности сырья (кожа, мех, шерсть). Образцы исследуемого материала измельчают и кипятят в пробирке с изотоническим раствором хлорида натрия в течение 5—10 мин, после чего фильтруют до полной прозрачности. Преципитирующую сибиреязвенную сыворотку получают путем гипериммунизации лошадей убитой культурой B.anthracis. Испытуемый термоэкстракт осторожно наслаивают на поверхность сыворотки в преципитационной пробирке. В положительном случае через 1—2 мин в месте соприкосновения появляется белое кольцо преципитации, что свидетельствует о присутствии в материале антигенов возбудителя. Контрольный термоэкстракт готовят из того же материала, взятого от здорового животного (см. табл. 10.1.1).

Кожно-аллергическая проба. Ставится на внутренней поверхности предплечья — внутрикожно вводят 0,1 мл антраксина. При положительной реакции через 24 ч появляются гиперемия и инфильтрат. Положительная реакция регистрируется у 90 % больных сибирской язвой, начиная со 2-й недели заболевания, и сохраняется у переболевших в течение всей жизни, в связи с чем ее диагностическая оценка должна производиться с осторожностью.