МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: гной из очага, кровь — при сепсисе.
МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:
Бактериоскопическое исследование (см. схему 12.1.1). Из исследуемого материала (за исключением крови) готовят мазки для первичной бактериоскопии, окрашивают по методу Грама и микроскопируют. Наличие в препаратах бактерий позволяет поставить ориентировочный диагноз и наметить план дальнейшего исследования.
Бактериологическое исследование. Посевы производят на элективные обогатительные среды для анаэробов (среда Китта—Та-роцци, тиогликолевый бульон или полужидкий тиогликолевый агар), содержащие специальные добавки (гемин, витамин К и др.), и инкубируют при 37 °С в течение 24—48 ч. После просмотра выросшей культуры делают мазки, окрашивают их по методу Грама и микроскопируют. Бактериоскопия дает возможность установить однородность или неоднородность куль-
туры, а по морфологии клеток и тинкториальным свойствам ориентировочно отнести ее к определенному роду. Для получения чистой культуры делают пересевы на плотные среды в чашки Петри и инкубируют в анаэробных условиях 3—4 сут до формирования изолированных колоний. После изучения колоний их пересевают на элективные среды. Идентификацию выделенной чистой культуры производят на основании присущих ей дифференциальных признаков, которые определяют также в строго анаэробных условиях (табл. 12.2.1).
Таблица 12.2.1. Дифференциальные признаки неспорообразующих и спорообразующих анаэробных бактерий
| Признак | Бактерии | ||||||||
| Рер- | Рер- | Veil- | Вас- | C.per- | C.no- | C.se- | C.so- | C.hi- | |
| to- | tost- | lone l- | teroi- | frin- | vy | pti- | rdel- | stoty- | |
| сос- CUS | repto-сос-cus | la | des | gens | cum | li | ticum |
Условные обозначения: (+) — наличие признака; (—) — отсутствие признака; х — непостоянный признак; (+) — отсутствие признака у большинства штаммов; (±) — наличие признака у большинства штаммов; с — слабая ферментация.
|
Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохимические и молекулярно-биологические исследования. Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Анаэробные бактерии вырабатывают специфические метаболиты, включая летучие жирные кислоты с короткой цепью, спирты и нелетучие органические кислоты. Для их обнаружения в материале от больного используют ГЖХ (см. главу 11).
• Микробиологическая диагностика раневой анаэробной кло-стридиалъной инфекции — газовая гангрена (схема 12.2.1).
МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: раневое отделяемое, отечная жидкость, кусочки мышечной ткани, перевязочный материал, кетгут. Рекомендуется брать материал из разных участков очага поражения, особенно из глубоких слоев. Кровь — при сепсисе.
МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:
Бактериоскопическое исследование. Проводят путем микроскопии мазков, приготовленных из отечной жидкости или некротизированной ткани. Наличие в препаратах крупных (1—1,5x3—10 мкм) грамположительных палочек, некоторые из которых (C.perfringens) образуют макрокапсулу (рис. 12.2.1; на вклейке), позволяет поставить предварительный диагноз.
Бактериологическое исследование. Исследуемый материал вносят в несколько пробирок со средой Китта—Тароцци, железо-сульфитным агаром (среда Вильсона—Блера) и молоком. Часть пробирок прогревают при 80 "С в течение 30 мин для уничтожения неспорообразующих бактерий. Посевы инкубируют в обычном термостате при 37 "С. C.perfringens растет в глубине среды. В молоке уже через 3—4 ч посева образуется губкооб-разный сгусток, содержащий пузырьки газа и отделившуюся прозрачную жидкость. Через сутки на среде Китта—Тароцци отмечается помутнение и газообразование, а на железосуль-фитном агаре несколько позднее появляются черные колонии в глубине агарового столбика. Для получения культур других видов клостридий требуются более строгие анаэробные условия. Из всех посевов делают мазки, окрашивают их по методу Грама и микроскопируют. При положительном результате обнаруживаются крупные грамположительные палочки.
Для получения чистой культуры делают пересевы на сахарный кровяной агар в чашки Петри и инкубируют в строго анаэробных условиях при 37 °С в течение 3—4 дней. Выросшие колонии пересевают в пробирки со средой Китта—Тароцци. Идентификацию чистой культуры производят на основании признаков, перечисленных в табл. 12.2.1. Идентификация по биохимическим признакам осуществляется традиционными методами или с помощью тест-систем для определения специфических бактериальных ферментов или метаболитов.
Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохимические и молекулярно-биологические исследования. Иммунохимические исследования. Лецитиназная проба: для быстрого обнаружения и серологической идентификации а-токсина клостридий в раневом отделяемом определяют его лецитиназ-ную активность в реакции нейтрализации (РН) с моновалентными антисыворотками против токсинов клостридий разных видов (табл. 12.2.2). С этой целью исследуемый материал (раневое отделяемое) помещают в пробирки с раствором лецитина и добавляют антисыворотки. Присутствие лецитиназы в раневом отделяемом выявляется помутнением жидкости в пробирке. При нейтрализации лецитиназной активности токсина соответствующей антисывороткой жидкость остается прозрачной.
Таблица 12.2.2. Постановка лецитиназной пробы для определения и идентификации токсинов клостридий в РН (форма протокола)
| Реагент | Количество реагента, мл | |||
| пробирка | пробирка | пробирка | пробирка | |
| Исследуемый материал 0,3 | 0,3 0,3 0,3 | |||
| Лецитин 0,1 | 0,1 0,1 - | |||
| Раствор хлорида натрия 0,1 | 0,2 | |||
| Сыворотка анти- C.perfringens — | 0,1 | |||
| Сыворотка анти- С. novy — | 0,1 | |||
| Инкубация при 37 "С в течение 46—60 мин | ||||
| Учет результатов (наличие | ||||
| помутнения) |
Примечание. При учете результатов используют обозначения: (+) — наличие помутнения; (—) — отсутствие помутнения.
Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих молекул можно поставить предварительный диагноз.
ГЖХ используют для обнаружения в материале от больного специфических метаболитов клостридий, включая летучие жирные кислоты с короткой цепью, спирты и нелетучие органические кислоты (см. главу 11).
Биопроба. Для серологической идентификации токсинов также можно использовать биопробу. Проводят РН токсина на лабораторных животных. С этой целью смесь исследуемого токсина с моновалентными антитоксическими сыворотками (к токсинам C.perfringens или других видов клостридий) вводят подкожно морской свинке. В случае нейтрализации токсина животное выживает; при отрицательной реакции морская свинка погибает через 30 мин — 4ч после инъекции.
• Микробиологическая диагностика столбняка (см. схему 12.2.1)
МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кусочки ткани вокруг предполагаемых входных ворот инфекции, перевязочный материал, кетгут. Рекомендуется брать материал из разных участков очага поражения, особенно из глубоких слоев. При подозрении на столбняк у женщин после родов или аборта — выделения из матки, у новорожденных — выделения из пупочной раны.
МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:
Бактериологическое исследование. Материал засевают в среду Китта—Тароцци и инкубируют в анаэробных условиях при 37 °С в течение 3—4 сут, наблюдая придонный рост бактерий. Затем делают посевы на сахарный агар в чашки Петри, в столбик сахарного питательного агара в пробирке. Посевы также инкубируют в анаэробных условиях. На поверхности кровяного агара C.tetani образует нежные прозрачные колонии, окруженные малозаметной зоной гемолиза. Для получения чистой культуры подозрительные колонии пересевают в пробирки со средой Китта—Тароцци и сохраняют их под слоем вазелинового масла или в эксикаторе, заполненном смесью инертных газов. Для определения способности выделенной чистой культуры к образованию столбнячного токсина (токси-генности) используют серологические реакции (преципитации в геле и др.) с антителами к тетаноспазмину. Бактериологический метод используют в качестве дополнительного метода для подтверждения диагноза, поскольку он не дает своевременного результата.
Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохимические и молекулярно-биологические исследования. Иммунохимические исследования. Токсин в материале может быть обнаружен с помощью серологических реакций in vitro (ИФА и др.). Метод позволяет получить ответ в течение нескольких часов и обеспечивает своевременную диагностику заболевания.
Биопроба. Проводят для обнаружения столбнячного токсина в исследуемом материале. С этой целью материал растирают в стерильной ступке с песком, заливают изотоническим раствором хлорида натрия для экстрагирования токсина и фильтруют через бумажный фильтр. Фильтрат вводят внутримышечно белым мышам. Животным контрольной группы вводят смесь фильтрата с антитоксической сывороткой. Через 1—2 сут у мышей появляется ригидность мышц хвоста и задних конечностей. В результате резкого сокращения хвостовых мышц хвост поднимается в виде дуги. Затем подопытные животные погибают. У животных в контрольной группе признаки инток-
| Эшерихиоз Шигеллез (бактериальная дизентерия) |
| » |
сикации отсутствуют вследствие нейтрализации токсина антисывороткой. В настоящее время биопроба практически не применяется.
• Диагностические, профилактические и лечебные препараты
Антитоксические противогангренозные сыворотки — моновалентные (антиперфрингенс, антиэдематиенс — антинови, анти-септикум и др.) и поливалентная. Сыворотки получают путем иммунизации лошадей соответствующими анатоксинами, с последующей очисткой и концентрацией методом ферментативного гидролиза (диаферм-3). Препараты выпускаются в жидком и сухом виде. Применяют для экстренной пассивной профилактики и специфической иммунотерапии газовой гангрены.
Адсорбированный столбнячный анатоксин. Получен путем обезвреживания формалином столбнячного токсина с последующей его очисткой, концентрацией и адсорбцией на гидрате оксида алюминия. Входит в состав ассоциированной коклюш-но-дифтерийно-столбнячной вакцины и других препаратов. Применяют для активной иммунизации против столбняка.
Противостолбнячная сыворотка. Получена из крови лошадей, гипериммунизированных столбнячным анатоксином. Очищена и концентрирована методом диаферм-3. Активность измеряется в международных единицах. Применяют для экстренной пассивной профилактики и лечения столбняка.
Иммуноглобулин человеческий противостолбнячный. Получен из гамма-глобулиновой фракции крови доноров, ревакциниро-ванных очищенным адсорбированным столбнячным анатоксином. Применяют для экстренной пассивной профилактики и лечения столбняка.
Антибиотики. Грамположительные бактерии — р-лактамные антибиотики, ванкомицин, тетрациклины, макро-лиды, линкомицины, метронидазол.
Грамотрицательные бактерии — р-лактамы, спектр действия которых сдвинут в сторону грамотрицательных микроорганизмов, хлорамфеникол, тетрациклины, сульфаниламиды, метронидазол.
Аминогликозиды и фторхинолоны, как правило, не активны по отношению к анаэробным микробам.
| Глава 13 |
