В результате этого разложение белков сопровождается выделением побочных продуктов:
аммиака (при дезаминировании аминокислот); сероводорода при использовании серосодержащих аминокислот (цистин, цистеин, метионин), индола при утилизации триптофана. Обнаружение подобных
продуктов свидетельствует об использовании вышеперечисленных соединений.
Определение образования индола 1 – 2 мл реактива Эрлиха (парадиметиламинобензальдегид, раство-
ренный в этаноле и соляной кислоте). При положительной реакции образуется красное кольцо на границе раздела со средой. В качестве индикатора могут выступать и фильтровальные бумажки, пропитанные насыщенным раствором щавелевой кислоты, которые помещают под пробку и которые изменяют цвет (от розового до красного) при образовании индола.
Определение образования сероводорода также проводят с использованием индикаторных бумажек, пропитанных раствором уксуснокислого свинца. почернение бумаги = сульфид свинца.
Определение образования аммиака индикаторной бумажки, пропитанной реактивом Крупа. Об образовании аммиака свидетельствует покраснение бумаги.
Билет 17.
- Рост клеток и популяций, основные параметры роста.
Под ростом понимают согласованное увеличение количества всех химических компонентов, формирующих клеточные структуры. В период сбалансированного роста удвоение биомассы сопровождается удвоением всех других учитываемых параметров популяции, например количества белка, ДНК, РНК и внутриклеточной воды. В условиях сбалансированного роста легко определить величину скорости роста бактериальной популяции в каждый момент времени, если из-мерить прирост любого компонента клетки по отношению к его исходному количеству. Коэффициент пропорциональности называют удельной скоростью роста (μ). где N – число клеток в единице объема; Х – масса клеток в единице объема; t – время. Зная удельную скорость роста, можно определить время генерации (g – время, необходимое для удвоения числа клеток популяции в часах или минутах).
Если рост клеток в культуре ограничен количеством внесенного в питательную среду компонента, то между его начальной концентрацией и полученной биомассой клеток существует постоянная линейная зависимость (при условии ограничения роста только по одному параметру).
Масса клеток, образованная на единицу использованного компонента среды, представляет собой величину, которую называют экономическим коэффициентом (или выходом биомассы) – Y. Эту величину определяют по уравнению где Х – масса сухого вещества клеток (г/мл культуры), вступившей в стационарную фазу роста; Х0 – масса сухого вещества клеток в 1 мл среды сразу после инокуляции среды; (Х – Х0) – урожай бактериальной культуры (урожай зависит от количества и природы используемых питательных веществ, а также от условий культивирования); (S0 – S) – количество потребленного субстрата.
В лабораторных и промышленных условиях используют два основных способа культивирования микроорганизмов: периодическое (статическое) и непрерывное (проточное).
Рост бактерий в периодической культуре происходит до тех пор, пока содержание какого-нибудь из необходимых им компонентов питательной среды не достигнет минимума, после чего рост прекращается. Несколько фаз роста, сменяющих друг друга: начальную (или лаг-) фазу; экспонен-
циальную, или логарифмическую, фазу; стационарную фазу; фазу отмирания.
Лаг-фаза, или фаза задержанного роста, охватывает промежуток времени между инокуляцией бактерий и достижением ими максимальной скорости деления. Продолжительность фазы определяется факторами: • Начальными условиями культивирования вносимого посевного материала.
• Возрастом посевного материала.
Фаза экспоненциального роста характеризуется постоянной максимальной скоростью деления клеток и скоростью роста. E. coli при 37 С делятся примерно каждые 20 мин.
Стационарная фаза наступает тогда, когда число жизнеспособных клеток достигает максимума и не увеличивается, так как скорость размножения бактерий равна скорости их отмирания. В стационарную фазу роста поведение клеток может регулировать апоптоз. У бактерий E. Coli он осуществляется особым опероном maz, представленным двумя генами: mazE и mazF. Продукт mazF – стабильный цитотоксический белок-киллер, а продукт mazE – нестабильн. белок МazE, разрушающий белок-киллер.
В фазе отмирания происходит экспоненциальное снижение числа живых клеток.
В условиях непрерывного (проточного) культивирования в сосуд, содержащий популяцию бактерий, подается свежая питательная среда и из него одновременно удаляется часть среды с клетками микроорганизмов. Хемостат состоит из сосуда-культиватора, в который с заданной постоянной скоростью поступает питательная среда. Примером хемостата в природе служит рубец жвачных животных. Турбидостат представляет собой ферментер, в котором поддерживается заданная плотность клеток за счет определения оптической плотности среды культивирования. Биореакторы, или ферментеры в пром.Культуры, в которых все клетки находятся на одинаковой стадии клеточного цикла и делятся одновременно, называют синхронными.
- Арзибактерии. Основные группы, свойства, применение.
Впервые стали известны в 1977 г. благодаря работам американских ученых К. Везе и Г. Фокса по изучению молекулярно-биохимических свойств биополимеров клеток разных видов бактерий.
1. Их клеточная стенка не имеет пептидогликана муреина, вместо ко-торого в состав клеточной стенки входят кислые полисахариды, белки или псевдомуреин, не содержащий в отличие от муреина мурамовой кислоты, а в пептидных мостиках – D-аминокислот. Вместо ацетилмурамовой кислоты в состав муреина входит ацетилталозаминуроновая кислота, что определило устойчивость архебактерий к антибиотикам, нарушающим синтез клеточных стенок у эубактерий, – пенициллину, ампициллину.
2. Мембраны архебактерий не содержат в составе липидов сложных эфиров глицерина и жирных кислот, а представлены особыми бифитанильными глицериновыми эфирами, образованными путем конденсации глицерина с терпеноидными спиртами.
3. В тРНК архебактерий изменена общая для всех других организмов петля тимин–псевдоуридин–цитидин, в которой вместо тимина присутствуют другие основания.
4. Наличие в генах, кодирующих тРНК, интронов, которые имеются только в эукариотических геномах, но отсутствуют у большинства эубактерий.
5. Наличие в геноме архебактерий многократно повторяющихся последовательностей, что характерно для хромосомной ДНК эукариот. В области нуклеоида у архебактерий содержатся белки гистоны.
6. Архебактерии имеют более сложную структуру аппаратов трансляции и транскрипции. ДНК-зависимая РНК-полимераза, осуществляющая процесс транскрипции у архебактерий, состоит из 9–12 субъединиц, у эубактерий – из 4–8 субъединиц. РНК-полимераза архебактерий, подобно таковым у эукариот, не ингибируются рифампицином, их активность стимулируется силибином.
7. Рибосомы архебактерий содержат относительно больше белков, чем рибосомы эубактерий, причем они представлены более кислыми формами по сравнению с белками рибосом эубактерий. Кроме того, процесс биосинтеза белков у архебактерий не ингибируется такими антибиотиками, как хлорамфеникол и стрептомицин.
8. Особенностью конструктивного метаболизма архебактерий является отсутствие фиксации СО2 в цикле Кальвина. Основным путем автотрофной его фиксации является восстановительный путь карбоновых кислот в различных его модификациях, присущий и некоторым эубактериям.
9. Архебактерии неспособны использовать сложные высокомолекулярные соединения. Среди них не обнаружено активных продуцентов гидролитических ферментов, что, возможно, является одной из причин отсутствия патогенных и паразитических форм.
10. Некоторые архебактерии, в частности метаногенные, синтезируют уникальный набор коферментов, не встречающийся у других организмов
11. Архебактерии занимают необычные, часто экстремальные по условиям окружающей среды высокоспециализированные экологические ниши.
12. Морфология клеток архебактерий беднее, чем эубактерий. Преобладают сферические и цилиндрические клетки, а также необычные плоские клетки, имеющие вид пластинок и коробочек разнообразной геометрической формы, сходные с кусочками битого стекла.
Метаногенные бактерии – самая многочисленная группа, являющаяся облигатными анаэробами. Большинство неподвижны, подвижные имеют полярные жгутики. Источниками энергии служат процессы окисления молекулярного водорода, оксида углерода, метанола, муравьиной и уксусной кислот, акцептором электронов является углекислый газ. В природных средах метаногенные бактерии развиваются в ассоциации с другими микроорганизмами, выполняя функцию конечного звена в трофической цепи – превращают продукты брожения этих микроорганизмов в метан. Основные места обитания: торфяные болота, ил на дне водоемов, очистные сооружения сточных вод, пищеварительный тракт животных. Представители метаногенных бактерий входят в роды Methanobacterium, Methanosarcina, Methanospirillum.
Анаэробные серовосстанавливающие бактерии представлены одним родом Archaeoglobus, который состоит из двух видов: A. fulgidus (типовой вид) и A. profundus. Это облигатные анаэробы и экстремальные термофилы. Бактерии рода Archaeoglobus – грамотрицательные кокковидные клетки неправильной формы, часто треугольные, одиночные или в парах, со жгутиками (монополярные политрихи) или без них. При освещении светом с длиной волны 420 нм обнаруживают голубовато-зеленую флуоресценцию. На агаризованной среде формируют зеленовато-черные гладкие колонии диаметром 1–2 мм. Способны к хемолитотрофному или хемоорганотрофному росту. Основная форма энергетического метаболизма – анаэробное дыхание (диссимиляционная сульфатредукция). Донорами электронов являются формиат, лактат, глюкоза, крахмал, белки и молекулярный водород; конечными акцепторами электронов – сульфат, сульфит и тиосульфат (но не молекулярная сера). Особенностью бактерий рода Archaeoglobus является способность в небольшом количестве образовывать метан. \
Основное местообитание серовосстанавливающих архебактерий – мелководные и глубоководные морские гидротермальные источники, в которых они вызывают восстановление соединений серы.
Экстремальные термофилы, метаболизирующие молекулярную серу – грамотрицательные бактерии разной морфологии: кокки, палочки, диски, нити или клетки неправильной дольчатой формы. Клеточные стенки у этих бактерий состоят из гликопротеиновых или белковых субъединиц. Цитоплазматические мембраны многослойные, содержат липиды, на основе тетраэфиров глицерина.
Экстремальные термофилы, метаболизирующие молекулярную серу, подразделяются на три порядка, четыре семейства и включают девять родов. Все представители объединены в одну группу благодаря тому, что их энергетический метаболизм связан с метаболизмом молекулярной серы. Облигатно аэробные бактерии (например, бактерии рода Sulfolobus); строгие анаэробы (например, бактерии ро-
дов Thermococcales и Thermoproteales); факультативные анаэробы (например, бактерии рода Acidianus).
Являются аборигенами высокотермальных кислых источников и грунтов в зонах вулканического происхождения. Кроме того, бактерии рода Pyrodictium выделяют из подводных морских горяч.источн.
Бактерии вида Sulfolobus brierley, способные выщелачивать металлы
Термоацидофильные микоплазмы представлены единственным видом Thermoplasma acidophilum. В отличие от других архебактерий, эти бактерии не имеют клеточной стенки. Клетки окружены трехслойной мембраной, толщиной около 7 нм, могут быть подвижными и обладать жгутиками.
Гетеротрофы со сложными пищевыми потребностями. Хемоорганотрофы, факультативные анаэробы. Энергию получают как за счет аэробного дыхания, так и за счет брожения. Облигатные термофилы и облигатные ацидофилы. Естественным местообитанием их служат саморазогревающиеся отходы каменного угля и кислые термальные источники.
В группу экстремально галофильных бактерий входят бактерии с разной морфологией клеток.
Галобактерии распространены там, где есть: высокое содержание NaCl и других необходимых ионов,
. У представителей рода Halobacterium клеточная стенка построена из регулярно расположенных гексагональных субъединиц, состоящих в основном из гликопротеинов. Клеточная стенка галобактерий рода Halococcus имеет гетерополисахаридную природу.
Цитоплазматическая мембрана галобактерий содержит липиды, в молекулах которых глицерин связан не с остатками жирных кислот, а с С20- терпеноидным спиртом – фитанолом. Включают много каротиноидных пигментов (основной – бактериоруберин)против избыточной радиации,.
При недостатке в среде молекулярного кислорода в цитоплазматической мембране галобактерий индуцируется синтез хромопротеина – бактериородопсина, белка, соединенного ковалентной связью с каротиноидом ретиналем.Хромопротеин откладывается в виде отдельных пурпурных областей
(бляшек) красного цвета на цитоплазматической мембране.
Экстремальные галофилы имеют сложные пищевые потребности. Метаболизм глюкозы осуществляется по модифицированному пути Энтнера Дудорова. Этот путь отличается у галобактерий тем, что глю-
коза без фосфорилирования окисляется в глюконовую кислоту. Последняя превращается в 2-кето-3-дезоксиглюконовую кислоту, которая расщепляется на два С3-фрагмента: пировиноградную кислоту и глицериновый альдегид. Из глицеринового альдегида в результате нескольких ферментативных реакций также образуется ПВК. Дальнейшее окисление происходит в замкнутом цикле Кребса.
Основной способ получения энергии экстремальными галофилами аэробное дыхание. Использование световой энергии для создания трансмембр. градиента протонов происходит с участ. бактериородопсина и не связано с переносом электронов по цепи переносчиков. Шиффово основание в темноте находится в протонированной форме. Поглощение кванта света бактериородопсином вызывает изменение конформации ретиналя и приводит к отщеплению Н+ от Шиффова основания. Протон, переходит во внеклеточное пространство, а Н+, протонирующий Шиффово основание, поглощается из цитоплазмы.
В результате работы циклического механизма, получившего название бактериородопсиновой протонной помпы, при освещении по разные стороны мембраны возникает градиент концентрации Н+, достигающий 200 мВ. Разрядка протонного градиента с помощью Н+-АТФ- синтазы приводит к синтезу АТФ.
- Простые и сложные методы окрашивания. Примеры.
красителей, которые можно разделить на: • позитивные (метиленовый синий, фуксин) и негативные (нигрозин). Позитивными называются красители, окрашивающие микроорганизмы и другие находящиеся на стекле фиксированные объекты, негативными – красители, заполняющие пространство, окружающее микроорганизмы, в результате чего последние становятся видимыми в виде силуэтов на фоне красителя;• кислые (эозин, конго красный) и щелочные (гематоксилин, толуидиновый синий, азур). Кислые красители связываются с веществами, имеющими щелочную реакцию (например, цитоплазматическими белками), щелочные – связываются с базофильными (кислыми) компонентами клеток (нуклеиновыми кислотами, рибосомами).Способность клеток воспринимать различные красители отражаетих тинкториальные свойства. Это определяется стр-рой и сост. клеточной стенки.
Простыми методами окрашивания называют окрашивание препаратов каким-либо одним красителем. Чаще всего при этом используется фуксин, генциановый фиолетовый, метиленовый синий. В случае
использования негативных красителей среда, в которой находятся микроорганизмы, становится полупрозрачной; в результате клетки, в которые краситель не проникает, выглядят как светлые частицы на равномерно окрашенном фоне. Некоторые микроорганизмы, например спирохеты, плохо выявляемые с помощью позитивных красителей, легко выявляются при окрашивании негативными красителями.
При сложных методах окрашивания на один и тот же препарат воздействуют несколькими красящими веществами, одно из которых называется основным, другие – дополнительными. Кроме красителей
используются различные обесцвечивающие вещества: спирты, кислоты, ацетон и др. С помощью сложных методов окрашивания выявляют цитологические особенности клеток микроорганизмов Окраска по методу Грама является самым универсальным из сложных методов окраски. Окраска положена в основу дифференциации бактерий и отражает способность клеток воспринимать и удержи-
вать внутри клетки красящий комплекс генцианового фиолетового и иода либо терять его после обработки спиртом. Соответственно выделяют грампол. (Bacillus, Clostridium, Staphylococcus, Sarcina, Streptococcus,Lactobacillus) и грамотр. (Escherichia,Pseudomonas, Erwinia, Neisseria, Rickettsiа)
