Цвет, грамотрицательные – в розовый. Билет 20. Действие хим.факторов на микроорганизмы

Билет 20.

1. Действие хим.факторов на микроорганизмы.

Некоторые химические вещества действуют опосредованно, т. е. приводят к микробостатическому эффекту, не поражая саму клетку микроорганизмов(варенье). Химические соединения по механизму:

• на повреждающие клеточную стенку или цитоплазматическую мембрану (лизоцим и фенолы, хлороформ, крезолы, нейтральные мыла, поверхностно-активные вещества или детергенты, эфиры, ионы водорода, спирты, толуолы);

• повреждающие ферменты, участвующие в обмене в-в, нарушающие синтез основных биополимеров.

Концентрация ионов водорода в окружающей среде действует на микроорганизмы двояко:

1) непосредственно на полупроницаемость цитоплазматической мембраны; 2) косвенно или опосредованно: а) через влияние на ионное состояние и доступность многих ионов и метаболитов; б) стабильность макромолекул; в) равновесие зарядов на поверхности клетки.

При низких значениях рН увеличивается суммарный положительный заряд, понижается растворимость углекислого газа, а растворимость Cu2+, Mo2+, Mg2+, Al3+, возрастает и достигает токсичных уровней. Многие органические кислоты при низких значениях рН находятся в недиссоциированной форме и легко проникают в клетку, становясь токсичными для нее. При высоких значениях рН увелич. суммарный отрицательный заряд, растворимость многих катионов, необходимых клетке (Fe2+, Ca2+, Mn2+), резко понижается, они выпадают в осадок и становятся недоступными для клеток.

увеличивается суммарный положительный заряд, при высоких – суммарный отрицательный заряд. Кроме того, в кислой среде разрушаются ДНК и АТФ, а в щелочной – РНК и фосфолипиды.

В зависимости от отношения к кислотности

1) нейтрофилы – оптимальное значение рН для роста составляет 6–8, от 4 до 9. Большинство микроорг. Типичными нейтрофилами: бактерий Escherichia coli, Bacillus megaterium, Streptococcus faecalis;

2) ацидофилы – оптимальная кислотность среды для роста ниже 4 единиц рН. Среди них различают факультативные и облигатные ацидофилы. Род Thiobacillus, Sulfolobus, Acetobacter и др.;

3) алкалофилы – оптимальные условия для развития находятся в пределах значений рН 9,0–10,5, которые встречаются в щелочных почвах, в местах скопления экскрементов животных. Среди алкалофилов различают факультативных алкалофилы, к которым относятся нитратвосстанавливающие и сульфатвосстанавливающие бактерии, многие аммонификаторы. Облигатные алкалофилы растут при высоких значениях. К таким бактериям относятся Bacillus pasteurii, некоторые цианобактерии и др.

Ионы тяжелых металлов (Hg2+, Ag+, Cu2+, Co2+, Pb2+, Ni2+, Zn2+, Cd2+) могут взаимодействовать с гидроксильными, сульфгидрильными, карбоксильными группами, а также аминогруппами, вызывая изменения свойств белков и коферментов. В результате ингибирования ферментных систем

нарушаются дыхание, синтез РНК и белков.Цианиды действуют как дыхательные яды – связывая железо, они блокируют функцию терминального дыхательного фермента цитохром-оксидазы. Оксид углерода подавляет дыхание, конкурируя со свободным кислородом за цитохромоксидазу. Окислители KMnO4, иод, H2O2 и другие вызывают резкое усиление окислительных процессов, приводящее к отмиранию клетки.

К группе химических веществ, нарушающих синтез клеточных компонентов, относятся структурные аналоги соответствующих соединений – антиметаболиты. Аналогом сукцината является малонат:

В присутствии малоновой кислоты даже в низких концентрациях подавляется превращение сукцината в фумарат. Н-р, включение производных сульфаниловой кислоты (сульфаниламидов) в фолиевую

кислоту (витамин Вс, или фолацин) вместо п-аминобензойной кислоты. Если в состав питательной среды внести сульфаниламид, то он будет включаться в фолиевую кислоту, что приведет к синтезу неполноценного витамина и в конечном счете к остановке роста клеток.

К микробостатическим агентам, которые ограничивают рост нежелательной микрофлоры относятся консерванты. Чаще других применяемыми являются поваренная соль и сахар. Используются орг. кислоты: лимонная, молочная, уксусная, пропионовая, бензойная, сорбиновая, а также их соли. Для консервирования фруктов, ягод, соков, вин используют диоксид серы (SO2), а также жидкие сульфиты.

1. Актиномицеты.

относятся к порядку Actinomycetales, в который входят бактерии, имеющие тенденцию к образованию ветвящихся гиф, способных развиваться в мицелий. Мицелий может быть плотным, субстратным, врастающим в питательную среду или же рыхлым, воздушным на поверхности колонии. Различают мицелий стабильный и распадающийся на палочковидные или кокковидные элементы, некоторые из

них обладают подвижностью за счет жгутиков. Мицелий может нести интеркалярные везикулы, не содержащие спор либо содержащие многочисленные споры. Кроме того, для актиномицетов характерно образование конидий (бесполых спор), которые похожи на бактериальные эндоспоры и служат для перенесения неблагоприятных условий внешней среды. Характер расположения конидий отличается.

Образование спорангиев – мешков, содержащих споры. Они могут образовываться на хорошо развитых

воздушных гифах или на поверхности конидий со слабо развитым воз-душным мицелием либо без него, либо главным образом в толще агара.

Кроме морфол. критериев, используются данные о хим.стр-ре некоторых соединений:

• типе двухосновной аминокислоты, присутствующей в составе клеточной стенки (мезо- или L-диаминопимелиновая кислота);

• типе диагностических сахаров, содержащихся в гидролизате целых клеток.

Культуры актиномицетов по окраске делятся на две группы: бесцветные и пигментированные.

Актиномицеты – грамположительные организмы, хотя реакция по Граму может изменяться с возрастом культуры. Большинство аэробы, но некоторые роды представлены факультативными или облигатными анаэробами. Хемоорганогетеротрофы, использующие разнообразные источники энергии: углеводы, органические кислоты, спирты, крахмал, декстрин, клетчатку, различные углеводородные соединения (парафин и другие продукты переработки нефти), жиры, воски, лигнин, хитин. Встречаются как свободноживущие в разнообразных местообитанияхтак и симбиотические азотфиксирующие ассоциации с растениями (род Frankia). Встречаются чаще в почве и реже – в пресной воде. Есть патогенные для человека, животных и растений виды. Споры могут быть аллергенными для человека.

Нокардиоформные актиномицеты. Это гетерогенная группа, образуют нити мицелия, распадающиеся на более короткие элементы. Для некоторых - воздушного мицелия с цепочками спор. Подразделение на роды основано на хемотипе клеточной стенки, присутствии или отсутствии миколовых кислот.Эта группа актиномицетов разделена на четыре погруппы:

-Бактерии, содержащие миколовые кислоты входят 4 рода: Gordona (из почвы,легочным туберкулезом); Nocardia (в почве,возбудителями нокардиоза); Rhodococcus (в почве и помете травоядных, патогенны); Tsukamurella (выделены из почвы, мокроты человека,возбудители легочной инфекции).

- Pseudonocardia и близкие роды выделяются из из почвы и растительного материала, аллергия.

-Nocardioides и Terrabacter состоит из двух родов бактерий: Nocardioides и Terrabacter. В почве.

-Promicromonospora. Из почвы и раст.материала.3 рода: Jonesia, Oerskovia и Promicromonospora.

Роды с многогнездными спорангиями нитей мицелия, делящихся в продольном и поперечном направлениях, и большого числа кокковидных элементов, которые могут быть подвижными или неподвижными. 3 рода:

• Dermatophilus – паразиты млекопит, экссудативный дерматит (например, Dermatophilus congolensis)

• Frankia –симбионты ряда покрытосеменных растений и как свободноживущие в почве;

• Geodermatophilus – местообитание почва.

Актинопланы. нити мицелия которых не распадаются на фрагменты; воздушный мицелий развит слабо или отсутствует. Они образуют подвижные или неподвижные споры в спорангиях, одиночные либо в цепочках. Клеточные стенки содержат мезо-диаминопимелиновую кислоту и глицин, в гидролизатах целых клеток присутствуют арабиноза и ксилоза. Местообитание – почва, разлагающийся рас-

тительный материал, пресная и морская вода, ил. Группа включает 6 родов: Actinoplanes, Ampullariella, Catellaspora, Dactylosporangium, Micromonospora, Pilimelia.

Стрептомицеты и близкие роды. клеточные стенки, содержащие L-диаминопиколиновую кислоту и глицин. Нити мицелия не распадаются на фрагменты и могут образовывать обильный воздушный мицелий с длинными цепочками спор (роды Streptomyces и Streptoverticilium). Для других родов (Intrasporangium, Kineosporia, Sporichthya) характерно слабое развитие воздушного мицелия либо полное его отсутствие и разнообразные по форме споры.

В группу входит пять родов: Streptomyces, Streptoverticillium, Intrasporangium, Kineosporia, Sporichthya. Основное местообитание представителей этих родов – почва, но есть патогенные для человека и животных или растений виды. Типовой род – Streptomyces. Все стрептомицеты – облигатные аэробы.

Преимущественно сапрофиты. Стрептомицеты широко распространены в почвах разных типов и играют большую роль в минерализационных процессах. Их наличие обусловливает специфический запах свежевспаханной почвы. Наличием у них активных ферментных систем.

Str. aureofaciens синтезируют также витамин В12 и его аналоги. Str. scabies, которые являются возбудителями парши картофеля.

Мадуромицеты. нити мицелия образуют развитый воздушный мицелий, несущий споры. Клеточные стенки содержат мезодиаминопимелиновую кислоту, а гидролизаты целых клеток мадурозу.

Эта группа разделена на две подгруппы: • Streptosporangium и родственные таксоны; • Actinomаdura.

В основном почвенные микроорганизмы, но среди них встречаются патогенные.

Thermoтоnospora и близкие виды. нити образуют воздушный мицелий со спорами, расположенными одиночно (род Thermотоnonospora), в цепочках (роды Actinosynnema, Nocardiopsis) или в споран-

гиеподобных структурах (род Streptoalloteichys). Клеточные стенки содержат мезо-диаминопимелиновую кислоту; в гидролизатах целых клеток характерные аминокислоты и сахара отсутствуют. Миколовые кислоты также отсутствуют. Основное местообитание – почва.

Thermoactinomyces нити мицелия образуют воздушный мицелий. Одиночные споры (представляющие собой эндоспоры) имеются как на воздушном, так и на субстратном мицелии. Все виды термофильные. Клеточные стенки содержат мезо-диаминопимелиновую кислоту; характерные аминокислоты и сахара отсутствуют. Аэробы; сапрофитные хемоорганотрофы. Группа представлена только одним родом – Thermoactinomyces.

Другие роды. Эта группа включает три рода: Glycomyces, Kitasatosporia, Saccharothrix. Образуют воздушный мицелий с цепочками спор. В составе клеточной стенки отсутствуют миколовые кислоты. Аэробы, хемоорганотрофы. Выделены из почвы.

1. Чистые культуры бактерий и методы их выделения.

Чистой культурой микроорганизмов называют популяцию бактерий одного вида, представляющую потомство одной клетки. Выделение чистой культуры предполагает проведение трех этапов: 1)получение накопительной к-ры; 2) выделение чистой к-ры; 3) определение чистоты выделенной к-ры.

Чаще всего это делают путем изолирования отдельных клеток на твердой питательной среде, используя метод посева штрихом или разлива по чашкам небольшого количества жидкой культуры (метод предельных разведений). Получение изолированных колоний на твердой питательной среде достигается либо путем рассева взвеси микроорганизмов шпателем (метод Коха), либо с помощью бактер-ой петли (метод истощающего штриха). Рассев шпателем (метод Коха). Рассев петлей (метод истощающ.штриха) предполагает высев бактериологической петлей из накопительной культуры на поверхность агариз. среды в ч.Петри. Последовательные разведения в твердой среде – самый простойспособ посева по чашкам, после инокуляции пробы в пробирку со стерильным расплавленным и охлажденным агаром среду перемешивают, выливают в чашку Петри и дают ей застыть. Для получения хорошо изолиров. колоний готовят ряд последовательных десятикратных разведений и по 1 мл проб вносят сразу в чашку, добавляют 15 – 20 мл расплавленной агаризованной среды и смешивают, покачивая чашку. Иногда отдельные колонии оказываются погруженными в агар и извлечь их можно только механически.

Определение чистоты выделенной культуры

Выросшие изолированные колонии отсевают бактериологической петлей на поверхность скошенной агаризованной среды в пробирке. При визуальном контроле исследуют рост культуры по штриху на поверхности скошенной среды; в том случае, если рост неоднороден, считают, что культура загрязнена и требуется ее дополнительная расчистка. При описании колоний бактерий определяют их диаметр в миллиметрах, пигментацию, форму (точечная, круглая, волокнистая, неправильная, ризоидная), высоту, профиль (плоский, высокий, выпуклый), вид края.

Билет 19.

1. Биосинтез аминокислот

 

Источником азота для аминокислот у разных групп бактерий являются нитраты, нитриты, молекулярный азот, аммиак. Перевод неорганического азота в орг. соединения происходит всегда через образование аммиака, и поэтому нитраты, нитриты, молекулярный азот предварительно восстанавливаются до аммиака и только после этого включ. в состав орг. соедин.

Восстановительное аминирование кетокислот аммиаком. При взаимодействии а-кетоглутаровой кислоты с аммиаком при участии фермента глутаматдегидрогеназы образуется глутаминовая кислота:

При участии фермента аланиндегидрогеназы пировиноградная кислота взаимодействует с аммиаком с образованием аланина:

Некотор.ак образуются путем амидирования. Из глутаминовой кислоты с участием фермента глутаминсинтетазы образуется глутамин:

Большинство получает аминогруппу от одной из пе- рвичных ак в результате трансаминирования, или переаминирования. Из свободных аминокислот в цитоплазме бактерий количественно преобладает глутаминовая кислота. Она служит донором аминогрупп при биосинтезе многих аминокислот. Глу взаимодействуя со щук при участии фермента аминотрансферазы, обеспечивает образование аспарагиновой кислоты. Отдав аминогруппу, глу в а-кетоглутаровую, которая выступает в качестве стартового вещества для синтеза глутаминовой кислоты.

Путь биосинтеза ароматических ак (триптофана, фенилаланина, тирозина). Как уже отмечалось, исходными веществами для их синтеза являются эритрозо-4-фосфат и фосфо-енолпируват. Молекулы этих веществ конденсируются с образованием С7-соединения, которое подвергается циклизации, образуя 5-дегидрохинат. Через ряд этапов 5-дегидрохинат превращается в хоризмовую кислоту, которая является общим промежуточным продуктом биосинтеза всех ароматических аминокислот. На этом этапе биосинтет. путь разветвляется, один путь ведет к биосинтезу триптофана через антраниловую к-ту, а другой – префеновой к-ты, кот. является предшеств. как тирозина, так и фенилаланина.

 

1. Донорские и реципиентные бактерии.

Если стрептомицинустойчивым был штамм В, а штамм А – стрептомицинчувствительным, то на минимальной глюкозо-солевой среде со стрептомицином формировались клоны прототрофных клеток.

Штамм А: met^– bio^– thr⁺ leu⁺ thi⁺Str-s и Штамм B: met⁺ bio⁺ thr^– leu^– thi^–Str-r=

Позднее У. Хейс показал, что существуют бактерии мужского (доноры) и женского (реципиенты) типа и вклад их в конъюгацию не равнозначен. Перенос генетического материала происходит в одном направлении – от донора к реципиенту и процесс рекомбинации протекает в клетках штамма-реципиента. Рекомбинанты наследуют большинство своих признаков от реципиента, а от донора получают только отдельные фрагменты генома.

У. Хейс ввел понятие о наличии в донорных клетках F-фактора (fertility – плодовитость) и обозначил доноры F⁺-клетками, а реципиенты – F^–-клетками. Если взять F^–-клетки и добавить к ним F+-клетки, смесь поместить в оптимальные условия, то через несколько часов F^–-клетки превратятся в клетки F+. Это значит, что при контакте клеток F-фактор быстро передается из F+-клеток в F–-клетки, а частота передачи F-фактора близка к 100 %. Таким образом, клетки-реципиенты в результате конъюгации

превращаются в потенциальных доноров, но при этом хромосомные признаки не передаются или передаются с крайне низкой частотой (ниже10^–5).В результате рекомбинации генов донорной хромосомы с хромосомой реципиента образовывались рекомбинанты по разным признакам. Такие донорные штаммы получили название Hfr соответственно первым буквам от английского high frequency of recombination.

От состояния F-фактора различают два типа донорных клеток:

• F⁺-доноры, у которых F-фактор находится в автономном от хромосомы состоянии. При скрещивании F+-доноров с F–-реципиентами передается, как правило, только F-фактор:

• доноры Hfr-типа, у которых F-фактор интегрирован в хромосому. При скрещивании Hfr-доноров с F–-реципиентами передаются хромосомные гены с образованием рекомбинантов (F ^-).

F-фактор может исключаться из хромосомы, и в этом случае клетка Hfr становится F+-клеткой. Неправильная эксцизия F-фактора - с незаконной или запрещенной рекомбинацией, возникающей меж-

ду негомологичными генетическими участками полового фактора и хромосомы. В состав полового фактора включается фрагмент бактериальной хромосомы. F-факторы, содержащие фрагменты хромосомной ДНК, по-лучили название F*-факторов, а штаммы – F*-донорами.

Различают малые и большие F*-факторы. Один ген, или до половины бактериальной хромосомы.

F*-факторы, как и обычные F-факторы, с высокой эффективностью передаются при конъюгации F–-клеткам. При этом они с высокой частотой переносят в реципиентные клетки и бактериальные гены, которые включены в их состав. Такой тип передачи генов получил название сексдукции или F-дукции, что схематично можно изобразить следующим образом.

В результате скрещивания такого типа реципиентная клетка приобретает способность к сбраживанию лактозы и несет аллель как lac+ (находится в составе F*-фактора), так и аллель lac– (в хромосоме). Клетки, в которых определенные нуклеотидные последовательности представлены в двойном наборе – в составе хромосомы и в F*-факторе, называются гетерогенотами. У них обнаружена повышенная способность к образованию Hfr-клеток. При этом интеграция F*-фактора осуществляется в об-

ласти хромосомы, гомологичной фрагменту, включенному в состав F*-фактора. В противоположность этому, F-фактор F+-клетки не имеет предпочтительного места соединения с хромосомой.

 

1. Культивирование аэробных организмов.

Культивирование аэробных микроорганизмов проводят следующим образом: • на поверхности плотных сред или в тонком слое жидких сред, когда микроорганизмы получают кислород непосредственно из воздуха; • в жидких средах (глубинное культивирование). В этом случае микроорганизмы используют растворенный в среде кислород. В связи с низкой растворимостью кислорода, для обеспечения роста аэробных бактерий в толще среды, требуется постоянное аэрирование. Наиболее простой и широко распространенный в лабораторной практике способ глубинного культивирования – выращивание на шейкерах (качалках), обеспечивающих встряхивание колб или пробирок со скоростью 100–200 об/мин и более. Аэрировать кул-ру можно продуванием под давлением через толщу среды стерильного воздуха.

Билет 25.

1. Брожение смешанного типа.

Этот вид брожения характерен для энтеробактерий, входящих в семейство Enterobacteriaceae. К их числу относят Escherichia coli, Proteus vulgaris, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens, Erwinia amylovora, Salmonella typhi, Shigella dysenteriae, Yersinia pestis и др.

Энтеробактерии являются факультативными анаэробами: при наличии воздуха они осуществляют аэробное дыхание, а в анаэробных условиях – брожение, продуктами которого являются уксусная, муравьиная, янтарная и молочная кислоты, этанол, ацетоин, 2,3-бутандиол, СО2 и молекулярный водород. Брожение получило название муравьинокислого, потому что характерным, хотя и не главным продуктом брожения, является муравьиная кислота.

При брожении смешанного типа гексозы используются в основном по гликолитическому пути, и только у незначительной части микроорганизмов – по пентозофосфатному пути. Катаболизм глюконата проходит по пути Энтнера – Дудорова.

1. Брожение, характерное для бактерий родов Escherichia, Salmonella, Shigella, Citrobacter, Yersinia, при котором образуются главным образом кислоты (молочная, уксусная, янтарная, муравьиная). Кроме органических кислот, выделяются газообразные продукты СО2 и Н2 (в соотношении 1:1), образуется этанол и совсем не синтезируется 2,3-бутандиол Выход АТФ в этом случае составляет 2–2,5 молекулы АТФ на одну молекулу глюкозы. Кроме двух молекул АТФ, образующихся в процессе гликолиза, еще некоторое количество АТФ синтезируется в реакции, катализируемой ацетаткиназой.

2. Брожение, характерное для бактерий родов Enterobacter, Serratia, Pantoea, Erwinia. При таком брожении органических кислот синтезируется значительно меньше, чем в брожении первого типа, однако больше образуется СО2 и этанола. Кроме того, основным продуктом такого брожения является 2,3-бутандиол и соответственно этот тип брожения называют иначе бутандиоловым.

 

Ацетоин образуется из двух молекул пирувата. Процесс его образования включает двукратное декарбоксилирование и поэтому в бутандиоловом брожении СО2 выделяется намного больше, чем в предыдущем случае. Но в этом брожении синтезируется меньше кислот, так как образование бутандиола конкурирует за промежуточный продукт – пируват. Выход АТФ – две молекулы на одну молекулу глюкозы. Таким образом, анализируя рассмотренные типы брожений, можно заключить, что наиболее выгодным для клетки с энергетической точки зрения, является маслянокислое. В этом случае при потреблении одной молекулы глюкозы образуется в среднем 3,3 молекулы АТФ.

 

 

1. Бактериальные токсины. Примеры.

Экзотоксины продуцируются клеткой и выделяются в окр.ср. Эндотоксины прочно связаны с клеткой.

Экзотоксины называют истинными токсинами. Они впервые были обнаружены в 1890 г. у двух патогенных для человека микроорганизмов: Corynebacterium diphtheriae – возбудителя дифтерии (дифтерийная палочка) и Clostridium tetani – возбудителя столбняка (столбнячная палочка). Для доказательства продукции экзотоксинов поставлены одинаковые эксперименты: бактерии выращивали в питательной среде in vitro и бесклеточный фильтрат, приготовленный из выросшей культуры, вводили опытным животным.

По химической природе экзотоксины принадлежат к белкам. Они термолабильны и разрушаются при температуре 60–80.С в течение 10– 60 мин. Легко разрушаются под влиянием пищеварительных ферментов. При обработке формалином (0,3–0,4 %) при температуре 38–40.С экзотоксины обезвреживаются, но сохраняют при этом антигенность. Такие лишенные активности экзотоксины называются анатоксинами. Они используются как вакцины. При парентеральном введении анатоксинов в организме вырабатываются антитоксины (антитела), нейтрализующие соответствующие яды.

Гены, определяющие синтез бактериальных экзотоксинов случаях локализованы на плазмидах или в составе профагов. Дифтерийный и столбнячный токсины, а также токсин ботулизма детерминируются генами профагов. Патогенные бактерии продуцируют их лишь в том случае, когда в хромосоме находится профаг. Синтез некоторых токсинов, продуцируемых штаммами Escherichia coli и других, детерм-ся плазмид. генами (Ent-плазмиды). Утрата профага или плазмиды делает кл-ку нетоксигенной.

Экзотоксины высокотоксичны, их действие направлено на разрушение определенных субклеточных структур или на нарушение определенных клеточных процессов. Альфа-токсин одного из возбудителей газовой гангрены (Clostridium perfringens) является гидролитическим ферментом лецитиназой. Лецитин – важный липидный компонент клеточных и митохондриальных мембран.Дифтерийный токсин, синтезируемый Corynebacterium diphtheriae, образует комплекс с НАД+, который взаимодействует с одним из факторов трансляции белка (трансферазой II) в рибосомах, в результате чего происходит нарушение синтеза белка и клетка хозяина погибает. Столбнячный и ботулинический токсины относятся к нейротоксинам. При ботулизме токсин поражает периферическую нервную систему, при столбняке – центральную нервную систему. Столбнячный токсин блокирует импульс расслабления, сразу все мышцы, ботулинический действует за счет общего расслабления мышц. Паралич дыхания.

Холерный токсин проникает в кровь, активирует мембранную аденилатциклазу, что вызывает резкое увеличение концентрации цАМФ в клетке; это в свою очередь приводит к тому, что ионы Na+ не проникают в кровь. В кишечнике создаются гипертонические условия и вода поступает из тканей в кишечник. Потеря тканевой жидкости приводит к ацидозу и шоку.

Токсин палочки чумы ингибирует респираторную акт-сть митохондрий, что приводит к гибели клетки.

Эндотоксинами являются комплексы липополисахаридов с белками (липополисахаридпротеиновый комплекс), находящиеся в наружных слоях клеточных стенок грамотрицательных бактерий. Они вырабатываются возбудителями брюшного типа, паратифов, дизентерии и рядом других энтеробактерий (в том числе патогенными штаммами кишечной палочки).

Эндотоксины термостабильны, выдерживают кипячение и автоклавирование при температуре 120.С в течение 30 мин, под действием формалина и температуры обезвреживаются частично. Действие эндотоксинов неспецифично и при введении в организм они всегда вызывают резкое повышение температуры. В липополисахаридпротеиновом комплексе за токсигенность и пирогенность (повышение температуры) отвечает липополисахаридная часть молекулы, а белковый фрагмент только за антигенные свойства. Эндотоксины – менее токсичны. Иногда эндотоксины вызывают воспалительные реакции, которые проявляются в увеличении проницаемости капилляров и разрушении клеток. При попадании значительного кол-ва эндотоксинов в кровоток возможен эндотоксиновый шок. Бактериальные эндотоксины проявляют сравнительно слабое иммуногенное действие, и иммунные сыворотки не способны полностью блокировать их токсические эффекты. Микроорганизмы, которые образуют экзо- и эндотоксины (холерный вибрион, гемолитические штаммы кишечной палочки и др.).

1. Методы определения подвижности. Окраска жгутиков.

Поступательное движение бактерий за счет жгутиков можно наблюдать во влажных препаратах, применяя в большинстве случаев светлопольный микроскоп. Наиболее эффективно наблюдение за под-

вижностью в темнопольном микроскопе. Чтобы убедиться, что жгутики действительно присущи данным микроорганизмам, а также определить их расположение (полярное, перитрихиальное, латеральное),требуются методы с применением окрашивания.

Для окрашивания жгутиков предложено несколько методов, общим этапом для которых является протравливание препарата (обычно растворами таннина, KAl(SO4)2, HgCl2) и последующая окраска (чащекарболовым раствором фуксина). В результате этого на жгутиках происходит осаждение красителя, благодаря чему одновременно достигается как увеличение их толщины, так и уменьшение прозрачности. Одним из предложенных методов окрашивания жгутиков является

метод Лейфзона. Техника: 1. Выращенные на скошенном агаре бактерии, осторожно ресуспендируют в пептонной воде. Бактериальной петлей суспензию наносят на предметное стекло и высушивают на воздухе. 2. Восковым стеклографом очерчивают вокруг бактериальной пленки прямоугольник.

3. Наносят на предметное стекло 1 мл раствора красителя таким образом, чтобы он не вытекал за пределы восковой линии. Оставляюкраситель на определенное время (до 1 часа). В состав красителя вхотдят 1,5 % хлористого натрия, 3 % таннина (дубильной кислоты) и 0,03 % фуксина.

4. Как только на поверхности красителя образуется золотистая пленка, а по всему мазку выпадет осадок, краситель удаляют под струей воды, а препарат высушивают на воздухе.

5. Препарат микроскопируют с иммерсионной системой. Клетки бактерий окрашиваются в красный цвет, жгутики принимают вид толстых нитей, отходящих от клетки.

Подвижность бактерий может быть выявлена с использованием техники посева в столбик агара. При этом культуру бактерий засеваютуколом в столбик 0,3 % питательной среды в пробирке. Пробирки по-

мещают в термостат для инкубирования. Результаты учитывают через 24 – 48 часов. Подвижные бактерии растут по всей толще агара, вызывая диффузное помутнение среды, неподвижные – только по линии укола.

Билет 26.

1. Энергетический метаболизм. Аэробное и анаэробное дыхание.

Энергетический метаболизм (катаболизм) – это совокупность реакций окисления различных восстановленных органических и неорганических соединений, сопровождающихся выделением энергии, аккумулируемой клеткой в форме фосфатных связей.

Хемотрофные микроорганизмы используют для синтеза молекул АТФ энергию, освобождаемую в результате химических реакций, фототрофные – световую энергию в процессе протекания фотосинтеза.

Синтез молекул АТФ из АДФ и фосфатов может происходить двумя способами:

• фосфорилированием в дыхательной или фотосинтетической электронтранспортной цепи. (мембранным фосфорилированием) Синтез АТФ в данном случае происходит при участии фермента АТФ-синтазы:

• фосфорилированием на уровне субстрата. При этом фосфатная группа переносится на АДФ от вещества (субстрата), более богатого энергией, чем АТФ.

У хемотрофных бактерий генерация энергии в молекулах АТФ сводится к двум типам биохимических реакций: окисления и восстановления.

При биологическом окислении чаще всего происходит одновременный перенос двух электронов; при этом от субстрата отщепляются также два протона (Н+) (дегидрирование).

Окислительно-восстановительные реакции энергетического метаболизма у хемотрофных:

• аэробное дыхание, или аэробное окисление; • анаэробное дыхание; • брожение.

аэробное дыхание, при котором донором водорода или электронов являются органические (реже неорганические) вещества, а конечным акцептором – молекулярный кислород. Основное количество энергии при аэробном дыхании образуется в электронтранспортной цепи, т. е. в результате мембранного фосфорилирования.

Анаэробное дыхание – цепь анаэробных окислительно-восстановительных реакций, которые сводятся к окислению органического или неорганического субстрата с использованием в качестве конечного акцептора электронов не молекулярного кислорода, а других неорганических веществ (нитрата –, нитрита –, сульфата –, сульфита), а также органических веществ (фумарата и др.). Молекулы АТФ в процессе анаэробного дыхания образуются в основном в электронтранспортной цепи, т. е. в результате реакций мембранного фосфорилирования, но в меньшем количестве.

Брожение – совокупность анаэробных окислительно-восстановительных реакций, при которых органические соединения служат как донорами, так и акцепторами электронов. АТФ при брожении синтезируется в результате реакций субстратного фосфорилирования.

У бактерий возможны три пути катаболизма глюкозы:

1) гликолиз, или фруктозодифосфатный путь, или путь Эмбдена – Мейергофа – Парнаса (по имени исследователей, внесших большой вклад в изучение этого процесса);

2) окислительный пентозофосфатный путь, или гексозомонофосфатный путь, или путь Варбурга – Диккенса – Хореккера;

3) 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатный путь (КДФГ-путь), или путь Энтнера – Дудорова.

Глюкоза сначала фосфорилируется при участии фермента гексокиназы и АТФ как донора фосфата. Образуется глюкозо-6-фосфат.

Гликолиз. С6Н12О6 + 2АДФ + 2Фн + 2НАД = 2С3Н4О3 + 2АТФ + 2НАД · Н2

Пентозофосфатный путь (семейства Enterobacteriaceae,гетероферментативных молочнокислых бактерий и некоторых маслянокислых бактерий). В этом цикле глюкозо-6-фосфат, образующийся путем

активирования глюкозы молекулой АТФ, превращается через ряд промежуточных реакций в 6-фосфоглюконовую кислоту, которая подвергается окислению и декарбоксилированию с образованием рибулозо-5- фосфата, СО2 и НАДФН2. Рибулозо-5-фосфат включается в сложный цикл, приводящий к образованию из трех его молекул двух молекул глюкозо-6-фосфата и одной молекулы 3-фосфоглицеринового альдегида. Глюкозо-6-фосфат может снова включаться в цикл, а 3-ФГА может быть превращен в пировиноградную кислоту.

Одна молекула АТФ. Он обеспечивает клетки бактерий пентозами (рибулозо-5-фосфатом). Образуются две молекулы НАДФН2.

Путь Энтнера – Дудорова характерен в основном для псевдомонад и уксуснокислых бактерий. 6-фосфоглюконовая кислота превращается в ПВК и 3-ФГА. Последний может превращаться в пировиноградную кислоту. Из одной молекулы глюкозы при функционировании этого пути синтезируется одна молекула АТФ, по одной молекуле НАДФН2 и НАДН2. Кратчайшим механизмом расщепления углеводов ПВК. Аэробное дыхание

Пвк окисляется с участием коэнзима А до ацетил-КоА. В данном процессе работают ферменты пируватдегидрогеназы: CH3–CO–COOH + KoA–SH + HAД+ = CH3–CO~KoA + НАД · Н2 + CO2 Ацетил-КоА является исходным субстратом цикла трикарбоновых кислот (ЦТК), или цикла Кребса.

В конечном итоге окисление ацетил-КоА в ЦТК приводит к образованию двух молекул СО2, одной молекулы АТФ и восьми атомов водорода, из которых шесть атомов связаны в молекулах пиридиннуклеотидов и два атома – в молекулах флавопротеинов.

У некоторых бактерий цикл трикарбоновых кислот «разорван». Отстутствует этап превращения а-кетоглутаровой кислоты в янтарную. В таком виде ЦТК не может функционировать в системе энер-

годающих реакций клетки. Основная функция «разорванного» ЦТК – биосинтетическая.

Образовавшиеся на разных этапах окисления органических веществ НАДН2 и ФАДН2, поступают в дыхательную цепь, которая у бактерий находится в цитоплазматической мембране. Они вновь окисляются до НАД и ФАД, а отщепившийся от них водород передается не менее чем через пять переносчиков на заключительный участок цепи, где соед-ся с молекулярным кислородом, образуя воду.

Транспорт водорода сопровождается протеканием ряда окислительно-восстановительных реакций. Достаточно энергии для образования АТФ, процесс окислительного фосфорилирования. Флавопротеины и хиноны осуществляют перенос атомов водорода, а FeS-белки и цитохромы – электронов. Энергетическю выход при окислении одной мол-лы глюк. при аэробн. дыхании у дрожжей: • в процессе гликолиза - по 2 АТФ, 2 НАДН2 и 2 пирувата; • при окислительном декарбоксилировании 2 пирувата образуются 2 ацетил-КоА и 2 НАДН2; • окисление двух молекул ацетил-КоА в цикле Кребса приводит к образованию 6 НАДН2, 2 ФАДН2 и 2 АТФ. При окислении одной молекулы НАДН2 = 3 АТФ, ФАДН2 = 2 АТФ. При окислении 10 молекул НАДН2 = 30 молекул АТФ, а двух молекул ФАДН2 = 4 молекулы АТФ. Суммарный энергетический выход аэробного дыхания у эукариотических микроорганизмов, когда катаболизм глюкозы осуществляется гликолитическим путем, составляет 38 молекул АТФ: С6Н12О6 + 6О2 + 38АДФ + 38Н3РО4 6СО2 + 38АТФ + 44Н2О

E. coli, когда ката-

болизм глюк.происх. гликолитич. путем, образуется 26 АТФ:

• 2 АТФ синтезир. в гликолизе;

• 2 АТФ синтезир. в двух оборотах цикла Кребса;

• 10 молекул НАДН2 приводят к синтезу 20 молекул АТФ;

• две молекулы ФАДН2 = 2 АТФ.

У других прокариот, таких как Corynebacterium diphtheriae, в дыха-

тельной цепи имеется только один пункт «выброса» протонов. У Mycobacterium

phlei – три, как в дыхательной цепи митохондрий дрожжей.

 

Бактерии, способные к анаэробному дыханию, имеют укороченные дыхательные цепи. В дыхательных цепях анаэробов цитохромоксидаза заменена соответствующими редуктазами. У строгих анаэробов не функционирует цикл Кребса или же он разорван.Основное количество молекул АТФ при анаэробном дыхании синтезируется в процессе мембранного фосфорилирования. Выход АТФ при анаэр.дых. меньше,чем при аэр-ом,но больше, чем при брожении. Конечным акцепторами электронов при нитратном дыхании являются нитраты или нитриты. Результатом нитратного дыхания является восстановление до газообразных продуктов. Суммарную реакцию нитратного дыхания, где окисляемым субстратом является глюкоза, а конечным акцептором электронов – нитраты: C₆H₁₂O₆ + 4NO₃₌6CO₂+6H₂O + 2N₂ + х (кДж) У денитрифицирующих бактерий функционирует полная и укороченная электр.цепь. В качестве конечного акцептора электронов выступает сульфат (SO₄), в результате чего происходит его восстановление до Н₂S. Получение энергии в результате сульфатного дыхания состоит из трех этапов • отрыва электронов от энергетического субстрата; • переноса их по дыхательной цепи• присоединения их к веществам, функционирующим в качестве конечных акцепторов электронов. Цикла Кребса «разорван» и функционирует только в условиях конструктивного метаболизма. Карбонатное дыхание – процесс окисления молекулярного водорода, при котором конечным акцептором электронов является СО2. Метаногенные бактерии в основном получают энергию за счет окисления молекулярного водорода в процессах, сопряженных с восстановлением СО2: 4Н2 + СО2 = СН4 + 2Н2О Многие метаногенные бактерии могут испол-вать для получен. энергии формиат, метанол, ацетат, а также метилированные амины: 4НСООН = СН4 + 3СО2 + 2Н2О, 4СН3ОН = 3СН4 + СО2 + 2Н2О, 4СО + 2Н2О = СН4 + 3СО2, СН3СООН = СН4 + СО2, 4СН3NH3 + 2H2O = 3CH4 + CO2 + 4NH4.

Восстановление фумарата в бактериальных клетках часто сопровождается образованием сукцината (Bacteroides, Fibrobacter, Wolinella). Кроме сукциногенных бактерий, к фумаратному дыханию способны многие другие хемоорганотрофы (энтеробактерии (роды Escherichia, Proteus, Salmonella).

По своей биологической сути брожение – это способ получения энергии, при котором АТФ образуется в результате анаэр. окисления органических субстратов в реакциях субстратного фосфорилирования.

Сиртовое. Катаболизм глюкозы проходит по гликолитич. пути до стадии синтеза пировиноградной кислоты. Далее осуществляется ее декарбоксилирование пируватдекарбоксилазой при участии тиаминпирофосфата, в результате чего образуются ацетальдегид и СО2. Ацетальдегид выступает конечным акцептором водорода. При помощи алкогольдегидрогеназы он восстанавливается до этанола.

C6H12O6 + 2Фн + 2АДФ = 2CH3CH2OH + 2CO2 + 2АТФ + 2H2O

Виды дрожжей (Saccharomyces cerevisiae, S. uvarum, Schizosaccharomyces pombe и др.) и бактерий (Erwinia amylovora, Sarcina ventriculi, Zymomonas mobilis). Кроме того, этанол образуют такие мезофильные бактерии, как Leuconostoc mesenteroides, Clostridium sporogenes, Spirochaeta aurantia, а также термофильные бактерии Thermoanaerobacter ethanolicus, Clostridium thermohydrosulfuricum.

Маслянокислое проходит в строго анаэробных условиях и осуществляют его облигатно-анаэробные бактерии рода Clostridium. Сбраживание углеводов по гликолитическому пути. Основной продукт брожения – масляная кислота синтезируется в результате конденсации двух молекул ацетил-КоА. Кроме того, одна из молекул ацетил-КоА, присоединяя неорганический фосфат, может подвергаться фосфорилированию, превращаясь в ацетилфосфат и далее в ацетат, что сопровождается синтезом АТФ при субстратном фосфорилировании. Это третья молекула АТФ, которая синтезируется при маслянокислом брожении (две другие молекулы АТФ образуются при расщеплении глюкозы по гликолитическому пути). Расчеты показали, что в целом на одну молекулу сбраживаемой глюкозы в маслянокислом брожении образуется 3,3 молекулы АТФ.

При гомоферментативном молочнокислом брожении синтезируется практически одна молочная кислота (90 % всех продуктов брожения). Катаболизм глюкозы в этом случае происходит по гликолитическому пути. Образ-яся при ПВК не подвергается декарбоксилированию, а под действием лактатдегидрогеназы восстанавливается до молочной к=ты. Конечным акцептором водорода выступает ПВК.

С6Н12О6 + 2АДФ + 2Фн = 2СН3 – СНОН – СООН + 2АТФ. Возбудителями гомоферментативного молочнокислого брожения являются, например, бактерии Streptococcus cremoris, S. lactis, Lactobacillus

bulgaricus, L. lactis и др.

Гетероферментативное молочнокислое брожение приводит к образованию разнообразных продуктов: молочной и уксусной кислот, этилового спирта, углекислого газа и глицерина. При этом типе брожения расщепление углеводов происходит по пентозофосфатному пути. Конечными акцепторами водорода являются ПВК и ацетальдегид. Возбудителями гетероферментативного молочнокислого броже-

ния являются бактерии видов Leuconostoc mesenteroides, Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus brevis.

Основным продуктом, образующимся при пропионовокислом брожении, является пропионовая кислота. Кроме нее, синтезируются уксусная кислота и СО2. 1,5Глюкоза = 2Пропионат + СО2 + Ацетат

Акрилатный путь (Clostridium propionicum, Bacteroides ruminicola, Megasphaera elsdenii).

Выход АТФ составляет одну молекулу на три молекулы потребленного в этом случае лактата.

Сукцинат-пропионатный функционирует у большинства микроорганизмов, образующих пропионат.

На этапе превращения фумарата в сукцинат происходит субстратное фосфорилирование, в результате чего образуется молекула АТФ.

смешанного типа 1. Брожение, характерное для бактерий родов Escherichia, Salmonella, Shigella, Citrobacter, Yersinia, при котором образуются главным образом кислоты (молочная, уксусная, янтарная, муравьиная). Выход АТФ в этом случае составляет 2–2,5 молекулы АТФ на одну молекулу глюкозы. (АТФ синтезируется в реакции, катализируемой ацетаткиназой)

2. Брожение, характерное для бактерий родов Enterobacter, Serratia, Pantoea, Erwinia. 2,3-бутандиол Выход АТФ – две молекулы на одну молекулу глюкозы.

2. Строение эндоспор. Спорообразование.

Эндоспоры бактерий – особый тип покоящихся клеток, в основном грамположительных бактерий. Эндоспоры формируются эндогенно, т. е. внутри материнской клетки, которая называется спорангием. Бактериальная эндоспора характеризуется повышенной резистентностью к нагреванию, действию уль-

трафиолетовых лучей, антибиотиков и других факторов.

К спорообразующим бактериям относится большое число грамположительных видов из 15 родов. Лучше всего процесс спорообразования изучен у представителей родов Bacillus и Clostridium. Бактерии рода Bacillus можно разделить на три группы: 1. Споры овальные, расположение их в материнской клетке центральное, растяжение клетки спорой не происходит.(B. subtilis, B. cereus, B. megaterium, B. anthracis, B. thuringiensis). 2. Споры овальные, имеющие толстую оболочку с выростами, расположение их в материнской клетке центральное. Они «растягивают» к-ки изнутри в ходе споруляции (B. polymyxa, B. stearothermophilus). 3. Споры сферические, расположение их в материнской клетке полярное. Эндоспоры «растягивают» клетку в ходе споруляции(B. pasteurii).

Процесс спорообразования энергозависим, поэтому от источника поступления энергии споруляцию разделяют на эндотрофную и экзотрофную. Эндотрофная споруляция осуществляется за счет внутреннего запаса энергии клетки и не нуждается в дополнительных веществах. В случае экзотроф-

ных процессов используется экзогенная энергия, поступающая извне. Способность к образованию спор детерминируется генами spo, бактерий Bacillus subtilis более 100.

Первый этап – подготовительный. В вегетативной клетке бактерий прекращаются ростовые процессы,

завершается репликация ДНК и распадается значительная часть белков материнской клетки, образуется специфич. для спор в-во – дипиколиновая к-та.(дипиколинат кальция - высокая терморезистентность).

Второй этап – формирование споры – начинается с особого неравного деления клетки. Цитоплазматическая мембрана вегетативной клетки образует впячивание (инвагинацию) от периферии к ее центру и отделяет часть протопласта материнской клетки. В результате этот протопласт содержит один нуклеоид с участком уплотненной цитоплазмы. Образования клеточной стенки между обоими протопластами не происходит. Вместо этого протопласт будущей споры обрастает цитоплазматическая мембрана материнской клетки, а образующаяся структура носит название предспоры или проспоры.

Предспора расположена внутри материнской клетки и ограничена от нее двумя мембранами. Мембрана протопласта споры синтезирует снаружи от себя стенку зародышевой клетки (зародыша). Мембрана, происходящая от материнской цитоплазматической мембраны, синтезирует вовнутрь кору споры или кортекс. Кортекс состоит из многослойного муреина, но более кислого. Синтез-ся еще и наружная оболочка споры, которая в значительной степени представлена полипептидами. У большинства видов спорообразующих бактерий эндоспора заключена еще в один дополнительный наружный слой – экзоспориум, в состав которого входят белки, липиды, углеводы.

Третий этап – созревание споры. Спора приобретает характерную форму и занимает определенное положение в клетке. Диаметр споры может превышать или не превышать диаметр вегетативной клет-

ки. Форму веретена или теннисной ракетки. Споры в клетке могут располагаться центрально (например, у Bacillus megaterium), субтерминально (Clostridium botulinum) или терминально (Clostridium tetani).

Споры освобождаются при лизисе спорангия. При попадании в благопр. Усл. споры прорастают в вегет. Кл-ки. Прорастания начинается с поглощения воды и гидратации структур споры, сопровождающихся активацией ферментов и возрастанием дыхания. Литические ферменты разрушают многослойные покровы споры, в среду выделяются дипиколинат кальция, аминокислоты и пептиды. В месте разрыва оболочки споры образуется ростовая трубка новой вегетативной клетки. Прорастание спор можно индуцировать, подвергнув их прогреванию до 60–70С в или кратковременному кипячению (10 мин при 100С). Тепловой шок должен проводиться перед высевом спор, так как процесс активации обратим.

Экзоспоры возникают путем почкования материнской клетки (метанокисляющих бактерий). Цисты – это шарообразные толстостенные клетки, формирование которых характерно для бактерий рода Azotobacter. В цисту превращается вся вегетативная клетка. Миксоспоры образуются также путем превращения всей клетки. Формирование миксоспор характерно для бактерий рода Myxococcus.

1. Методы количественного учёта микроорганизмов.

Количеству клеток в единице объема - титр клеток (или фаговых частиц).

Чтобы определить общее количество микроорганизмов в различных материалах, применяют методы прямого подсчета клеток под микроскопом (в специальных счетных камерах, в фиксированных мазках, намембранных фильтрах).

Подсчет клеток в окрашенных препаратах (метод Виноградского – Брида)

Преимущество: фиксированные окрашенные препараты хорошо сохраняются.

Техника: а) на хорошо обезжиренном предметном стекле маркером рисуют прямоугольник строго известной площади (2, 4 или 6 см2), б) на стекло в прямоугольник микропипеткой (или автоматической

пипеткой) наносят определенный объем суспензии клеток (0,01; 0,02 или 0,03 мл), в) суспензию равномерно распределяют петлей по всей площади прямоугольника, г) препарат высушивают на воздухе и фиксируют 15 мин 96 % этанолом, д) проводят окрашивание фуксином Циля 1 – 2 мин,

е) краситель сливают, препарат промывают водой, последовательно погружая стекло в 5 – 6 стаканов с водой) и высушивают на воздухе.

Количество клеток микроорганизмов подсчитывают, используя иммерсионный объектив, в квадратах окулярной сетки, которую помещают в окуляр между собирательной и глазной линзами.

Для получения достоверных результатов клетки микроорганизмов рекомендуется подсчитывать не менее чем в 50 – 100 полях зрения, а общее количество подсчитанных клеток не должно быть менее 600.

М – количество кл-ок в 1 мл; А – среднее число кл-к в квадрате

окулярной сетки (поле зрения); s и S – площадь квадрата окулярной

сетки (поля зрения) и приготовленного мазка в мкм2 соответственно;

V – объем нанесенной на стекло суспензии в мл; n – разведение.