Подсчет клеток на мембранных фильтрах

Этот метод используют для подсчета количества микроорганизмов в жидких материалах с низкой плотностью клеток. Метод основан на концентрировании клеток на поверхности фильтра в результате

фильтрации определенного объема исследуемой пробы с окрашиванием и подсчетом в микроскопе.

С помощью мембранного фильтрования могут быть подсчитаны как жизнеспособные клетки микроорганизмов, так и определено общее количество клеток. Техника: 1. Собирают прибор для фильтрования под вакуумом. Дляэтого основание стерильного фильтродержателя вставляют в стериль-

ную колбу Бунзена, с помощью стерильного пинцета помещают в фильтродержатель стерильный фильтр и закрепляют зажимом. Отводной конец колбы Бунзена соединяют с вакуумным насосом.

2. Строго определенный объем исследуемого материала пропускают через мембранный фильтр, создавая с помощью насоса вакуум. 3. Фильтр, с осевшими клетками микроорганизмов, снимают сте-

рильным пинцетом и исследую в зависимости от целей эксперимента.

Проводят окрашивание фильтра 5 % раствором эритрозина в 5 % растворе фенола. Для этого фильтр помещают нижней стороной в чашкуПетри на фильтровальную бумагу, насыщенную красителем, чашкузакрывают и оставляют на 30 – 60 мин. Фильтр отмывают от красителя, последовательно перенося его в чашки Петри с фильтровальной бумагой, насыщенной дистиллированной водой до тех пор, пока он не перестанет окрашивать влажную фильтровальную бумагу. Фильтр высушивают на воздухе и готовят препарат для микроскопирования. На предметное стекло накапывают иммерсион-

ное масло и помещают на него окрашенный мембранный фильтр таким образом, чтобы клетки микроорганизмов были сверху. На поверхность фильтра наносят еще каплю иммерсионного масла и по-

крывают фильтр покровным стеклом.

где М – количество клеток в 1 мл; а – среднее число клеток в квадрате

окулярной сетки (поле зрения); s и F – площадь квадрата окулярной

сетки (поля зрения) и мембранного фильтра в мм2, соответственно;

V – объем профильтрованной суспензии в мл; 10⁶ – коэффициент пе-

ревода мм2 в мкм2.

При подсчете колоний для увеличения контрастности мембранный фильтр с колониями окрашивают. Для этого поверхность фильтра, находящегося в чашке Петри, заливают 0,01 % водным раствором окса-

лата малахитового, который через 8 – 10 с сливают. При этом способе окрашивания колонии выглядят белыми или желтыми на фоне зеленого фильтра.

Метод подсчета клеток на мембранных фильтрах с помощью люминесцентного микроскопа заключается в концентрировании бактерий из исследуемого материала на нелюминесцирующий мембранный фильтр, флюорохромировании акридиновым оранжевым и подсчете клеток в специальном (люминесцентном) микроскопе. Этот метод удобен тем, что позволяет непосредственно подсчитать как общееколичество клеток, так и количество жизнеспособных клеток. При окрашивании акридиновыми красителями жизнеспособные клетки имеют зеленую, а нежизнесобные (мертвые) – красную окраску.

Определение количества микробных клеток нефелометрическим методом точно и сравнительно быстро определить количество клеток в культуральной среде. В определенных пределах рассеивание света клетками пропорционально их численности. Величину светорассеяния измеряют с помощью нефелометров, спектрофотометров или фотоэлектроколориметров.

Для построения калибровочной кривой поступают следующим образом. Измеряют величину светорассеяния взвеси с различным содержанием клеток и в каждой из них одним из доступных способов подсчитывают количество клеток в единице объема. Полученную зависимость выражают графически, откладывая на осях: абсцисс – показания нефелометра, ординат – количество клеток, содержащихся в 1 мл. Калибровочные кривые индивидуальны для каждой культуры.

Определение количества жизнеспособных клеток путем высева на питательные среды (чашечный метод Коха) Сущность метода подсчета количества клеток путем высева заклю-

чается в высеве определенного объема исследуемой суспензии микроорганизмов на агаризованную питательную среду в чашках Петри и подсчете формирующихся колоний, принимая во внимание, что каждая колония – потомство одной жизнеспособной клетки.

При посеве на поверхность агара (метод Коха) проводят три этапа: приготовление разведений исследуемого материала, посев на агаризованную среду в чашках Петри и подсчет сформировавшихся колоний.Разведения готовят в физиологическом растворе, используя шаг разведения 10^-1.

Высевы на плотную среду проводят, как правило, из трех последних разведений, причем делают два параллельных высева на отдельные чашки.

При расчете количества клеток микроорганизмов в 1 мл исходной суспензии суммируют результаты параллельных высевов из одного и того же разведения и определяют среднее количество колоний для

данного разведения. Лучшим разведением следует считать то, при высеве из которого на агаризованной питательной среде сформировалось от 30 до 300 колоний.

где М – количество клеток в 1 мл; а – среднее количество колоний при

высеве из данного разведения; V – объем 84 асуспензии в мл, взятой для

посева; 10 – коэффициент разведения; n – порядковый номер разведения.

Метод посева в агаризованную среду осуществляют путем внесения в стерильную чашку Петри суспензии микроорганизмов из соответствующего разведения с последующим заливанием расплавленной и охлажденной агаризованной средой. Содержим. чашки перемеш. и дают среде застыть.

Метод посева в тонком слое предполагает внесение разведенной суспензии микроорганизмов в пробирки с небольшим объемом (2,5 – 3,5 мл) расплавленной полужидкой агаризованной средой, которую затем разливают по стерильным чашкам, уже содержащим один слой застывшей агаризованной среды и дают застыть верхнему слою.

Билет 27

1. История развития микробиологии. В РБ.

Открытие микроорганизмов связано с именем голландского естествоиспытателя Антони ван Левенгука (1632–1723), который, заинтересовавшись строением льняного волокна, отшлифовал несколько грубых

линз.

Это был морфологический, или описательный период развития микробиологии, который продолжался с конца XVII до середины XIX в.

Начало изучению физиологии и биохимии микроорганизмов, выяснению их роли в природе

и жизни человека положил французский ученый Луи Пастер (1822–1895). С его работ начался физиологический период микробиологии. Л. Пастер впервые в противоположность мнению химиков показал, что процессы брожения и гниения обусловливаются жизнедеятельностью микроорганизмов,

специфических для каждого вида брожения. Пастер открыл принципиально новое биологическое явление – анаэробиоз. Неоценимый вклад внес Пастер в медицинскую микробиологию. Пастер доказал микробную природу таких заболеваний человека и животных, как сибирская язва, куриная холера, бешенство. Кроме того, он разработал способ борьбы с возбудителями этих заболеваний с помощью вакцин – культур патогенных микроорганизмов с ослабленными вирулентными свойствами.

Прогресс микробиологии в конце XIX в. был неразрывно связан с работами знаменитого немецкого ученого Роберта Коха (1843–1910), занимавшегося изучением возбудителей инфекционных заболеваний. Свои исследования Кох начал с изучения сибирской язвы и показал, что возбудителями этого заболевания являются бактерии вида Bacillus anthracis. Позднее он открыл возбудителей туберкулеза (бактерии вида Mycobacterium tuberculosis), которые в его честь были названы «палочкой Коха». Постулаты Коха:

1. Микроорганизм обнаруживают в каждом случае конкретного предполагаемого заболевания, а также в условиях, ответственных за патологические изменения и клиническое течение болезни.

2. Микроорганизм не выделяют при других болезнях как случайный или не патогенный паразит.

3. После изоляции из организма больного и выделения чистой культуры патогенный микроорганизм должен вызвать аналогичное заболевание у восприимчивого животного.

• разработали методы окраски микроорганизмов анилиновыми красителями; • усовершенствовали технику микроскопирования.• ввели в плотные питательные среды. • разработали методику выделения чистых культур бактерий из изолированных колоний на плотных средах; чашками Петри;

• внедрили в микробиологическую практику дезинфекцию.

Родоначальником русской микробиологии является Л. С. Ценковский (1822–1887). Он впервые дал научнообоснованную классификацию микроорганизмов, установил близость бактерий к сине-зеленым водорослям. Создал вакцину против сибирской язвы.

Велика заслуга в развитии микробиологии И. И. Мечникова (1845–1916). Он открыл явление фагоцитоза. Он изучал патогенез холеры и биологию холероподобных вибрионов, показал возможность заражения шимпанзе сифилисом и предложил метод лечения сифилиса монохлоридом ртути.

И. И. Мечников является также основоположником учения о микробном антагонизме, послужившем основой для развития науки об антибиотикотерапии.

Микробиолог и эпидемиолог Н. Ф. Гамалея (1859–1949), который внес большой вклад в изучение туберкулеза, холеры, бешенства, организовал в России первую бактериологическую станцию и ввел в практику вакцинацию людей против бешенства. Он создал также противохолерную и оспенную вакцины, впервые описал явление лизиса бактерий под действием агентов, которые впоследствии

были названы бактериофагами. Большой вклад в развитие микробиологии внес Д. И. Ивановский

(1864–1920), который в 1892 г. открыл вирус, вызывающий мозаичную болезнь табака.

С. Н. Виноградского (1856–1953) внес значительный вклад в познание физиологического многообразия микроорганизмов. Он открыл процесс хемосинтеза, открыл новый хемолитоавтотрофный тип питания микроорганизмов. Заслугой Виноградского является и то, что он впервые выделил из почвы анаэробные бак терии, способные фиксировать молекул. азот, названные в честь Пастера Clostridium pasteurianum.

Виноградский предложил создавать специфические (элективные) условия, способствующие преимущественному развитию данной группы микроорганизмов, т. е. он разработал метод накопительных культур.

Принцип выделения микроорганизмов, основанный на методе накопительных культур, был успешно развит голландским миробиологом М. Бейеринком (1851–1931). Он впервые выделил из почвы чистые культуры клубеньковых бактерий (симбиотических азотфиксаторов) и аэробных свободноживущих азотфиксирующих бактерий Azotobacter chroоcoccum. Кроме того, Бейеринк выделил чистые культуры сульфатредуцирующих бактерий, которые составляют важное звено в круговороте серы.

Ученик С. Н. Виноградского В. Л. Омелянский (1867–1928) многое сделал для изучения нитрифицирующих, азотфиксирующих и пектинолитических бактерий. Он впервые выделил целлюлозоразрушающие бактерии, описал их физиологию и химизм брожения клетчатки. В. Л. Омелянский написал первый учебник по микробиологии на русском языке.

Таким образом, выдающиеся ученые во второй половине XIX в. заложили прочный фундамент об-

щей микробиологии, на котором в ХХ в. эта наука достигла расцвета.

Развитие микробиологии в ХХ в. ознаменовалось крупными открытиями в области биохимии и генетики микроорганизмов. Так, в 1925 г. Г. А. Надсон (1867–1940) впервые получил индуцированные мутации дрожжей посредством облучения клеток рентгеновскими лучами.

В середине 50-х годов ХХ в. А. Клюйвер (1888–1956) и К. ван Ниль (1897–1985) провели сравнительное биохимическое изучение относительно далеко отстоящих друг от друга физиологических групп.

Закономерности процессов энергетического и конструктивного метаболизма для всех микроорганизмов едины.

В 1941 г. американские исследователи Дж. Бидл (1903–1989) и Э. Татум (1909–1975), изучая проявление индуцированных мутаций у грибов рода Neurospora, сумели приблизиться к пониманию функций генов и сформулировали свой знаменитый постулат «один ген – один фермент».

В 1944 г. американские ученые О. Эвери, К. Мак-Леод и М. Мак- Карти доказали роль ДНК в хранении и передаче наследственной информации, осуществив эксперименты по генетической трансформации у

бактерий.

Исследования Дж. Ледерберга, Э. Татума и Н. Циндера в период с 1946 по 1952 г. показали наличие половой дифференциации у бактерий. Они открыли и изучили трансдукцию и конъюгацию, а также закономерности рекомбинации генетического материала.

В 1953 г. Дж. Уотсон и Фр. Крик расшифровали строение молекулы ДНК, раскрыли генетический код, механизмы репликации ДНК и регуляции синтеза белка.

Успехи в области генетики микроорганизмов обусловили развитие нового направления – молекулярной генетики, являющейся основой генетической инженерии. Генетическая инженерия внесла потенциально

новые идеи и методы в производство широкого спектра биологически активных веществ. Открытия и достижения, полученные на микроорганизмах, явились также основой для возникновения таких новых научных направлений, как молекулярная биология, молекулярная биотехнология, молекулярная вирусология, белковая инженерия и др.

Современный период развития микробиологии тесно связан с научнотехническим прогрессом, потребностями народного хозяйства и здравоохранения. Он характеризуется комплексностью исследований, направленных как на решение общебиологических проблем, так и задач, связанных с рациональным использованием природных ресурсов, охраной окружающей среды, развитием сельского хозяйства, здравоохранения, микробиологической, горнодобывающей и биотехнологической пром.

 

 

1. Нуклеоид. Репликация ДНК.

Генетический материал прокариот представлен молекулой (молекулами) ДНК, уложенной в компактную структуру и локализованной в ограниченных участках цитоплазмы, не имеющей, в отличие от эукариот, собственной ядерной мембраны. Учитывая эти особенности, генетический аппарат прокариот принято называть нуклеоидом.

Тот факт, что в состав нуклеоида входит ДНК, впервые удалось показать Ж. Кейрнсу с помощью метода радиоавтографии.

Стабилизирующую роль в такой организации играют специфические белки. У бактерий кишечной группы известно по меньшей мере пять белков – HU, INF, H1, HLP1 и H, которые способствуют «упаковке» ДНК. Они сходны по аминокислотному составу и другим свойствам с гистонами эукариот, имеют сравнительно небольшие размеры (9–28 кД) и в большинстве своем относятся к основным. Наибольшее значение в играет белок HU. Связываясь с ДНК, он меняет конформацию ее витков.

Важную роль играет прикрепление нуклеоида к цитоплазматической мембране. Имеются фиксированные точки прикрепления нуклеоида к мембране: точка начала репликации и точка завер-

шения репликации. Кроме того, нуклеоид имеет «скользящие участки» прикрепления к мембране,тот участок, в котором в данный момент идет репликация, и большое кол-во «неспецифических» точек.

В зависимости от условий нуклеоид бактериальной клетки может состоять из одной или нескольких копий одной и той же хромосомы. Так, у Azotobacter chroococcum в экспоненциальной фазе роста

на одну клетку приходится 20–25 копий хромосомы, у Desulfovibrio gigas – 9–17 копий хромосомы.

У одной из наименьших по размеру бактерий Mycoplasma genitalium, вызывающей у людей уретриты, хромосомная ДНК равна 580.070 п. н.; у бактерий E. coli – 4.653.831 п. н. Нить хромосомной ДНК у бактерий E. coli имеет линейный размер в 1,6 мм, а длина упакованного нуклеоида – 1 мкм, что короче хромосомы в 1600 раз.

Уже отмечалось, что большинство бактерий – гаплоидные организмы. Однако у различных видов бруцелл, Rhodobacter sphaeroides, Agrobacterium tumefaciens, Leptospira interrogans клетки имеют по две хромосомы, различающиеся между собой по величине. У Burkholderia cepacia имеются даже три.

Актиномицеты –ложное кольцо. Линейная хромосома была обнаружена и у Rhodococcus fascians. Считается, что теоретически возможны три механизма репликации ДНК:

1. Консервативный, при котором сохраняется целостность всей родительской двойной спирали (не происходит раскручивания спирали), и она является матрицей для синтеза себе подобной.

2. Дисперсивный, в соответствии с которым родительская молекула ДНК распадается на фрагменты, а синтез новых цепей происходит на фрагментах, которые затем крест-накрест объединяются с отрезками нового материала.

3. Полуконсервативный предполагает, что родительская двойная спираль раскручивается, и каждая полинуклеотидная цепь служит матрицей для синтеза новой комплементарной цепи.

В 1957 г. М. Меселсон и Ф. Сталь экспериментально доказали, что репликация хромосомной ДНК у бактерий происходит по полуконсервативному механизму.

В этом процессе участвует несколько ферментов, основными из них являются:

1) ДНК-геликазы, перемещающиеся по цепи ДНК в направлении 5*>3* и перемещающиеся в направлении 3*>5*;

2) SSB-белки (single strand binding – связывающиеся с однонитевой ДНК), которые связываются с однонитевой ДНК и препятствуют ее ренатурации;

3) ДНК-гиразы, или топоизомеразы, белки, которые снимают напряжение при раскручивании кольцевых молекул ДНК и способствуют ее расплетанию.

На образовавшихся однонитевых участках ДНК идет синтез комплементарных цепей. У бактерий E. coli синтезируются три типа ДНК-полимераз (I, II и III). Главную роль играет ДНК-полимераза III.

Доказано, что синтез ДНК протекает только в направлении от 5* к 3*-ОН концу. Синтез одной из дочерних цепей осуществляется непрерывно с помощью ДНК-полимеразы III в направлении 5*> 3*.

Эта цепь называется ведущей, или лидирующей.

 

Копия второй цепи называется запаздывающей и она синтезируется из фрагментов ДНК размером 1000–2000 нуклеотидов, которые называются фрагментами Оказаки. Для синтеза фрагментов Оказаки

необходима «затравка», или праймер. К этой затравке ДНК-по-лимераза III присоединяет дезоксирибонуклеотиды, в результате образуются фрагменты Оказаки. РНК-праймеры удаляются за счет активности ДНК-полимеразы I, после чего лигаза сшивает отдельные фрагменты Оказаки друг с другом и целостность новой цепи восстанавливается.

Репликация всего кольца ДНК может происходить как в одном, так и в двух противоположных направлениях двойной спирали, что соответственно предполагает наличие одной или двух репликативных вилок на одной молекуле ДНК.

Обычно деление бактериальной клетки по времени осуществляется после завершения цикла репликации молекулы ДНК.

Бактериальную ДНК можно обнаружить в мембранных фракциях после центрифугирования клеточных лизатов, а также с помощью электронной микроскопии удалось визуализировать места прикрепления хромосомы к впячиваниям мембраны (мезосомам).

Существуют две модели, объясняющие регуляцию репликации бактериальной ДНК. Согласно модели, предложенной Ф. Жакобом, С. Бреннером и Ф. Кьюзеном (1963), структура, способная самостоятельно реплицироваться, называется репликоном: это относится к хромосомам и плазмидам бактерий. Репликон должен иметь кольцевую форму и реплицироваться не по частям, а как единое целое. Согласно этой модели, репликон должен быть прикреплен к цитоплазматической мембране и обяза-

тельно обладать двумя специфическими детерминантами или генами – структурным геном и геном-репликатором (или оператором репликации). При росте клетки от мембраны поступает сигнал на структурный ген и активирует его. Происходит синтез специфического белка-инициатора, который действует на ген-репликатор, что приводит к началу процесса репликации, который продолжается вдоль всего репликона и заканчивается копированием всей его структуры. После репликации ДНК поступает обратный сигнал на мембрану, инициируя деление клетки. Данная модель получила название модели позитивной регуляции репликации.

Кроме того, существует модель негативной регуляции репликации (Р. Притчард, П. Барт, Дж. Коллинз, 1969). В соответствии с этой моделью в составе репликона есть ген, отвечающий за синтез белка-репрессора, который при высокой концентрации негативно действует на инициацию репликации, а в малой концентрации не влияет на этот процесс. По мере роста клетки концентрация репрессора снижается и создается возможность репликации хромосомы или плазмиды.

 

1. Микробный антогонизм

один вид микроорганизмов полностью или частично подавляет рост и развитие других видов.

1. Антагонизм, складывающийся при совместном развитии разных видов, нуждающихся в одних и тех же питательных веществах. В этом случае преимущества будут у того микроорганизма, скорость роста

которого выше скорости роста других. Так, при совместном высеве на питательный субстрат, необходимый одновременно для роста и эубактерий и актиномицетов, эубактерии будут развиваться быстрее.

2. Антагонизм, связанный с образованием микроорганизмами органических кислот, спиртов, сидерофоров или других продуктов обмена, которые изменяют условия среды, делая ее непригодной для развития других микроорганизмов. В процессе смены микрофлоры свежего молока в нем содержатся как молочнокислые, так и гнилостные бактерии. Вначале они развиваются одинаково, но в результате размножения молочнокислых бактерий накапливается молочная кислота и молоко значительно подкисляется. В этих условиях наблюдается подавление роста, а затем и полная гибель гнилостных бактерий. При развитии уробактерий на среде, содержащей мочевину, происходит ее дезаминирование. Выделение аммиака происходит в таком количестве, которого достаточно для подщелачивания среды до рН 9,0.

3. Антагонизм, связанный с образованием и выделением в окружающую среду антибиотических веществ (антибиотиков, бактериоцинов и др.)

Билет 28

1. Цитоплазма. Производные цитоплазмы.

это содержимое клетки, окруженное цитоплазматической мембраной. Фракция цитоплазмы, имеющая гомогенную консистенцию и содержащая набор растворимых РНК, ферментных белков, продуктов и субстратов метаболических реакций, получила название цитозоля.

Рибосомы прокариот имеют константу седиментации 70S. Они образованы двумя субъединицами – 30S и 50S. Меньшая субъединица 30S сод. 16S-рРНК и в большинстве случаев по одной молекуле белков 21 вида. Субъединица 50S состоит из двух типов молекул рРНК (23S и 5S) и около 35 молекул белков.

Рибосомы служат местом синтеза белка. Синтез белка осуществляется агрегатами, состоящими из рибосом, РНК – иРНК и тРНК. Такие агрегаты наз-ся полисомами. Включения подразделяются на активно функционирующие структуры и продукты клеточного метаболизма откладывающиеся внутри

1. Аэросомы снижают удельную массу бактериальной клетки и благодаря этому поддерживают ее во взвешенном состоянии в водоеме. Аэросома представляет собой скопление газовых пузырьков (везикул), которые имеют веретенообразную форму. Их оболочка состоит только из белка, т. е. устроена не так, как обычная мембрана. Белковые молекулы ориентированы таким образом, что внутренняя сторона оказывается гидрофобной, а наружная – гидрофильной.

Хлоросомы зеленых бактерий и фикобилисомы цианобактерий. Пигменты, поглощающие кванты света и передающие энергию возбуждения на фотореакционные центры. Это эллипсовидные образования, окруженные тонкой белковой оболочкойиз отдельных глобул.

Карбоксисомы, или полиэдрические тела, содержатся в клетках некоторых автотрофных бактерий. Они имеют форму многогранника диаметром 90–100 нм, окруженного однослойной белковой оболочкой. В

карбоксисомах содержится рибулозо-1,5-дифосфаткарбоксилаза – ключевой фермент, катализирующий фиксацию СО2 в цикле Кальвина в процессе фото- и хемосинтеза.

Магнитосомы содержатся в водных бактериях, способных ориентироваться в магнитном поле и перемещаться в направлении линий магнитного поля. В их состав входит 0,4 % железа (по сухому веществу). Магнитосомы располагаются в клетках вблизи мест прикрепления жгутиков.

2.Запасные вещества – полифосфаты, полисахариды, жиры, сера. Эти вещества накапливаются, если в питательной среде находятся соответствующие исходные соединения, но вместе с тем рост бактерий ог-

раничен или вообще невозможен из-за недостатка каких-то отдельных компонентов питания или же присутствия ингибиторов. Запасные вещества содержатся в клетках в осмотически инертной форме, не растворимы в воде. В условиях, благоприятных для роста,они снова включаются в метаболизм.

Из полисахаридов: гликоген, крахмал и крахмалоподобное вещество гранулоза. Запасные вещества полисахариды образуются из молекул а-D-глюкозы, которые связаны а-1,4-гликозидными связями. Полиглюкозные цепи закручены винтообразно. Много крахмала имеют клетки бактерий рода Nеisseria и вида Acetobacter pasteurianus. Гранулоза содержится в большом количестве в клетках бактерий рода Clostridium. Гликоген, или «животный крахмал», синтезируется у бактерий E.coli, у бактерий рода Salmonella, у бацилл, дрожжей и других микроорганизмов.

Жиры накапливаются в виде гранул и (или) капелек, преломляющих свет по-иному, чем содержимое цитоплазмы, и поэтому хорошо различимы в световом микроскопе. Запасным жироподобным веществом многих бактерий (н-р,рода Pseudomonas) является поли-а-гидроксимасляная кислота.

Микроорганизмы могут накапливать также триглицериды (нейтральные жиры). Особенно много их запасается в клетках дрожжей и других грибов. Микобактерии могут содержать до 40 % восков.

Полифосфаты откладываются в гранулах, называемых волютиновыми или метахроматиновыми зернами.У многих бактерий, таких как пурпурные и бесцветные серобактерии, зеленые серные бактерии и других, окисляющих сульфид до сульфата, в процессе метаболизма в клетке откладывается молекулярная сера в виде шариков, сильно преломляющих свет.Специфическими запасными веществами цианобактерий являются цианофитиновые гранулы, состоящие из полипептида, в который входят аргинин и аспарагиновая кислота в эквимолярных количествах. Цианофитиновые гранулы служат резервом азота, который используется цианобактериями при его недостатке в среде.

1. Миксобакьерии и цитофаги

это грамотрицательные скользящие бактерии, относящиемя к порядкам Myxobacteriales и Cytophagales.

Миксобактерии имеют относительно крупные клетки двух морфологических типов: тонкие гибкие палочки с более или менее суженными концами и относительно толстые палочки цилиндрической формы с закругленными концами. Клетки миксобактерий обычно окрашены в желтый, оранжевый или красный цвет за счет каротиноидных пигментов.

Миксобактерии передвигаются путем скольжения по твердой поверхности и способны также проникать в субстрат, продвигаясь внутри, например 1,2–1,5 % агаровых гелей. Скользящие клетки всегда оставля-

ют за собой слизистые треки. В результате скользящего движения клеток колонии миксобактерий распространяются по поверхности субстрата и поэтому называются швармами. Внутри шварма клетки обычно распределены неравномерно, концентрируясь в радиальных тяжах, а иногда в массивных складках по периферии шварма. В условиях голодания клетки скапливаются и агрегируют в определенных участках шварма, образуя крупные глобулярные или гребневидные массы, которые затем дифференцируются в структуры, называемые плодовыми телами.

Плодовые тела варьируют в размерах от 100 до 600 мкм и хорошо заметны благодаря яркой окраске и блестящей поверхности. Плодовые тела имеют разную форму: от микроскопического бугорка до сложных древо- подобных структур, они могут располагаться концентрическими кругами или радиальными тяжами. Внутри вегет.к-ки превращаются в покоящиеся миксоспоры. Они устойчивы к высыханию и довольно устойчивы к нагреванию: выживают при температуре 58–60С в течение 10–60 мин. Миксоспоры могут иметь сферическую или овальную (например, у представителей родов Myxococcus, Nannocystis и др.) и палочковидную (например, у представителей родов Cystobacter, Polyangium, Stigmatella и др.) форму. Миксобактерии – облигатные аэробы. Большинство из них мезофиллы; оптимальная температура для роста 30–35.С. Все представители – хемоорганотрофы, способные использовать самые разнообразные органические вещества в качестве источников энергии и углерода. К бактериолитическим относятся миксобактерии, входящие в род Myxococcus, счет синтеза различных экзоферментов могут разрушать клетки бактерий, дрожжей и других микроорганизмов и использовать полученные вещества в качестве источников энергии и углерода. Такой тип взаимоотношений между микроорганизмами относится к хищничеству. Целлюлозолитические виды содержит род Polyangium. Некотор. миксобактерии способны синтезир.стеролы (н-р, рода Nannocystis).

Особенно обильно встречаются в теплых, полусухих и сухих местообитаниях, таких как степи и полупустыни субтропического и умеренного поясов. Типичные местообитания миксобактерий – почвы с нейтр. рН и нормальным содержанием солей, разлагающийся органический материал, включая помет травоядных животных и гниющую древесину, кора живых и отмерших деревьев, а также пресная вода.

В отличие от миксобактерий, цитофаги не образуют плодовых тел и имеют другой нуклеотидный состав ДНК. Содержание ГЦ у цитофаг 30– 50 %, у миксобактерий значительно выше – 67–71 %. Группа цитофаг включает восемь родов, представители которых могут обитать в почве, пресноводных и морских водоемах (например, роды Cytophaga, Flexibacter), полости рта (например, род Capnocytophaga), горячих источниках (например, род Thermonema).

Цитофаги – облигатные аэробы или факультативные анаэробы; хемоорганотрофы; метаболизм дыхательного, или бродильного, типа. Глюкозу сбраживают с образованием ацетата, пропионата, сукцината и некоторых других органических кислот. Отдельные представители могут осуществлять нитратное дыхание, используя в качестве конечного акцептора электронов NO. Для рода Cytophaga характерна сп-сть разлагать целлюлозу,агар,хитин,пектин,крахмал; рода Flexibacter – хитин и крахмал; р. Sporocytophaga–целлюлозу и целлобиозу; р.Microscilla-карбоксиметилцеллюлозу.Веретенообразные вегетативные клетки бактерий родов Sporocytophaga и Chitinophaga могут превращаться в длительно сохраняющиеся круглые клетки, окруженные капсулой – микроцисты (стадия покоя). Бактерии рода Flexithrix могут образовывать чехлы, которые окружают длинные многоклеточные. Встречаются патогенные представители. Н-р, бакт. рода Capnocytophaga выделяют из полости рта, очагов поражения в легких, крови и абсцессов. Бактерии вида Flexibacter columnaris – возбудитель заболеваний у рыб.

1. Техники окрашивания бактерий. Принцип отбора.

Окрашивание препаратов проводится с помощью красителей, которые можно разделить на:

• позитивные (метиленовый синий, фуксин) и негативные (нигрозин). Позитивными называются красители, окрашивающие микроорганизмы и другие находящиеся на стекле фиксированные объекты,

негативными – красители, заполняющие пространство, окружающее микроорганизмы, в результате чего последние становятся видимыми в виде силуэтов на фоне красителя;

• кислые (эозин, конго красный) и щелочные (гематоксилин, толуидиновый синий, азур). Кислые красители связываются с веществами, имеющими щелочную реакцию (например, цитоплазматическими

белками), щелочные – связываются с базофильными (кислыми) компонентами клеток (нуклеиновыми кислотами, рибосомами).

Способность клеток воспринимать различные красители отражаетих тинкториальные свойства. Это определяется структурой и составом клеточной стенки.

Простыми методами окрашивания называют окрашивание препаратов каким-либо одним красителем. Чаще всего при этом используется фуксин, генциановый фиолетовый, метиленовый синий. В случае

использования негативных красителей среда, в которой находятся микроорганизмы, становится полупрозрачной; в результате клетки, в которые краситель не проникает, выглядят как светлые частицы на равномерно окрашенном фоне. Некоторые микроорганизмы, например спирохеты, плохо выявляемые с помощью позитивных красителей, легко выявляются при окрашивании негативными красителями. Споры имеют вид преломляющих свет включений в вегетативной клетке.

Фиксированный препарат помещают на параллельные стеклянныерейки, которые лежат над кюветой. На мазок наносят 1 % водный раствор фуксина или метиленового синего на 1 – 2 мин. Следят за тем,

чтобы во время окрашивания раствор красителя не подсыхал. После завершения окрашивания препарат промывают водой до тех пор, пока стекающая воде не станет бесцветной. Затем препарат высушивают,

промокая его фильтр. бумагой, наносят на окрашенный сухой мазок каплю иммерсионного масла.

При сложных методах окрашивания на один и тот же препарат воздействуют несколькими красящими веществами, одно из которых называется основным, другие – дополнительными. Кроме красителей

используются различные обесцвечивающие вещества: спирты, кислоты, ацетон и др. С помощью сложных методов окрашивания выявляют цитологические особенности клеток микроорганизмов Окраска по методу Грама является самым универсальным из сложных методов окраски. Окраска положена в основу дифференциации бактерий и отражает способность клеток воспринимать и удержи-

вать внутри клетки красящий комплекс генцианового фиолетового и иода либо терять его после обработки спиртом. Соответственно выделяют грампол. (Bacillus, Clostridium, Staphylococcus, Sarcina, Streptococcus,Lactobacillus) и грамотр. (Escherichia,Pseudomonas, Erwinia, Neisseria, Rickettsiа)