- Мигрирующие элементы бактерий.
– дискретные сегменты ДНК, способные к самостоятельному перемещению из одного участка в другой в пределах репликона, а также к перемещению из одного репликона (хромосомного, плазмидного или
фагового) в другой. Интеграция в репликоны осущ-ся независимо от сист. общей рекомбинации кл-к.
IS-элементы представляют собой линейные фрагменты двухцепочечной ДНК длиной от 200 до 2000 п. н. Они содержат только гены tnp, кодирующие синтез фермента транспозазы, необходимого для их перемещения. По концам IS распол-ны инвертированные повторы (ITR) (Распол-ие нуклеотидов на разных концах перевернутое или противоположно ориентированное). У разных IS длина концевых повторов ITR варьирует от 8 до 40 п. н. Различают несколько типов: IS1, IS2, IS3, IS4 и др. Они отличаются друг от друга по длине (или кол-ву состав-их их пар основ.) и стр-рой концевых повторов. IS являются нормальными компонентами.Например, в F-факторе,одна копия IS2 и две копии IS3.
При перемещ. они могут встр-ся в пределах 1ого гена и инактивировать его или изменять его рег-цию.
Транспозоны – сложные перемещающиеся элементы. От IS они отличаются тем, что кроме генов, ответственных за транспозицию, содержат структурные гены, отвечающие за проявление какого-либо фенотипа. Длина свыше 2000 п. н. Тр-ны имеют концевые повторы (ITR), кот-ми часто служат IS-эл.
В зависимости от того, какие из IS-элементов и в какой ориентации ограничивают транспозон:
1. фланкированные (ограниченные) двумя IS1.а) в прямой ориентации.Такова структура транспозона Tn9.б) IS1 на концах транспозона в противоположной ориентации.Tn1681. 2. Фланкир. другими IS в прям. ориент.Tn2680. 3.фланкир. длин. инвертированными повторами, не идентичн. известным IS. Tn5.
Различают тр-ны с высокой Tn7, региональной Tn1, средней Tn9и10 и низкой Tn5 специфичностью.
Частота транспозиции транспозонов и IS-эл-ов происходит с вероятностью 10-4-10-7на одно деление.
Tn3: Во время первой стадии происходит слияние молекул донорной и реципиентной ДНК, сопровождающееся репликацией транспозона. Об-разуется коинтеграт, содержащий копии транспозона в местах слияния двух репликонов. Во время второй стадии происходит разрешение коинтеграта, и репликоны разделяются за счет сайт-специфической рекомбинации между идентичными участками двух транспозонов Tn3, находящихся в составе коинтеграта. Участки, в которых происходит
рекомбинация, названы от «internal resolution site» – IRS, res или tnpS. Для осуществления первой стадии перемещения необходимо наличие фермента транспозазы (продукта гена tnpA) и двух концевых инвертированных повторов. Белок, осуществляющий разрешение коинтеграта, был назван резолвазой или TnpR-белком. Синтез этого белка кодируется геном tnpR.-репликативной транспозицией. Наряду с ним существует способ транспозиции, предполагающий выщепление (эксцизию) перемещающегося элемента из молекулы донора и внедрение его (инсерцию) в молекулу реципиента. Этот механизм получил определение консервативной транспозиции. Она осуществляется также при участии сайт-специфической рекомбинации, однако здесь репликация транспозона необязательна.Значение транспозонов и IS-элементов определяется тем, что они:1) способны индуцировать образование мутаций 2) участвуют в слиянии и диссоциации репликонов 3) фагами могут обеспечивать перенос генов 4) используются в генетической инженерии in vivo и in vitro; 5) существенно ускоряют разработку частной генетики бактерий.
Бактериофаг Mu относится к умеренным бактериофагам.Сходство с IS-элементами и транспозонами в первую очередь выражается в том, что геном фага Mu (линейная двуспиральная ДНК – 38 т. п. н.) имеет на концах инвертированные повторы.Особенностью ДНК фага Mu, включенной в вирионы, является то, что на ее концах находятся участки бактериальной ДНК, которые захватываются при индукции профага и упаковываются вместе с фаговой ДНК в вирион. Может развиваться по литическому пути с образованием 50–100 частиц на клетку, которая при этом погибает, или же может интегрироваться в хромосому с образованием лизогенной клетки, содержащей его. Интегрироваться фаг Mu может в разные места бактериальной хромосомы, вызывая мутации разных генов.Фрагменты бактериальной хромосомы, которыми фланкирована вирионная ДНК, при интеграции ДНК фага Mu в реципиентную хромосому не встраиваются. Они элиминируются нуклеазами бактериальной клетки. ДНК фага Mu не вырезается, как у фага, а реплицируется в интегрированном состоянии, не покидая хозяйскую ДНК.
- Методы выделения мутантов устойчивых к антибиотикам.
Для их выделения в чашки Петри вносят питательный агар (10 мл), чтобы получился скошенный агар. После этого чашки ставят горизонтально и наливают в каждуюеще 10 мл агара с любым из антибиотиков в заданной концентрации (50, 100, 200 мкг/мл). В результате этого формируется градиент концентрации антибиотика от 0 мкг/мл на одном из краев чашки до максимальной – на другом.
По 0,1 мл культуры распределяют шпателем по поверхности агаризованной среды с градиентом концентрации антибиотика и инкубируют в оптимальных условиях. Отбирают устойчивые колонии и высевают на чашки с различными концентрациями антибиотика для оценки уровня устойчивости.
Прямой отбор широко используется для получения ревертантов (бактерий с обратными мутациями) ауксотрофных мутантов. Культуру ауксотрофных штаммов выращивают в полноценной среде до
поздней логарифмической стадии роста, центрифугируют и ресуспендируют в минимальной среде. Культуру засевают на поверхность агаризованной минимальной среды с помощью шпателя и стерильным пинцетом раскладывают диски из фильтровальной бумаги. На поверхность каждого диска наносят каплю одного из следующих растворов: стерильная вода (контроль); НГ, ЭМС и т. д. Чашки инкубируют, а о вызванных мутагенами обратных мутациях судят по росту колоний вокруг дисков. По полученной картине, зная специфичность мутагенов, можно определить природу исходных мутаций.
Для любой мутации, связанной с потерей генетической функции,
требуются такие методы выявления, которые позволили бы иденти-
фицировать очень редко возникающие мутантные клетки на большом
фоне немутантных. В эту группу входят ауксотрофные мутанты, му-
танты с изменениями в сбраживании углеводов, морфологические и
другие условно-летальные мутанты.
Билет 22.
- Анаэробное дыхание.
Конечным акцептором электронов в электронтранспортной цепи являются неорганические или органические соединения. Одним из немногих примеров конечным акцептором служит органическое вещество, является фумаратное дыхание.
Бактерии, способные к анаэробному дыханию, имеют укороченные дыхательные цепи. В дыхательных цепях анаэробов цитохромоксидаза заменена соответствующими редуктазами. У строгих анаэробов не функционирует цикл Кребса или же он разорван и выполняет только биосинтетические, но не энергетические функции. Основное количество молекул АТФ при анаэробном дыхании синтезирует-
ся в процессе мембранного фосфорилирования.
По отношению к молекулярному кислороду бактерии, являются факультативными или облигатными
анаэробами. К облигатным анаэробам относятся сульфатвосстанавливающие и метаногенные бактерии. К факультативным анаэробам – денитрифицирующие бактерии и бактерии, осуществляющие фумаратное дыхание.Выход АТФ при анаэр.дых. меньше,чем при аэр-ом,но больше, чем при брожении.
Конечным акцепторами электронов при нитратном дыхании являются нитраты или нитриты. Результатом нитратного дыхания является восстановление до газообразных продуктов.
Суммарную реакцию нитратного дыхания, где окисляемым субстратом является глюкоза, а конечным акцептором электронов – нитраты: C6H12O6 + 4NO3=6CO2+6H2O + 2N2 + х (кДж)
Первый этап: восстановление нитрата до нитрита, катализируют молибденсодержащие ферменты нитратредуктазы: NO3+2e+2H+=NO2+H2O
Второй этап: восстановление нитрита до оксида азота, катализируют нитритредуктазы:
NO2+e-+2H+=NO+H2O
*молекулярн.кислород ингибирует их активность, а также репрессирует синтез
Третий этап: восстановление оксида азота до закиси азота, катализируют редуктазы оксида азота:
2NO + 2е– + 2H+ =N2O + H2O
Четвертый этап: восстановление закиси азота в молекулярный азот, катализируют редуктазы закиси азота: N2O + 2е– + 2H+ =N2 + H2O
У денитрифицирующих бактерий функционирует полная и укороченная электр.цепь.
Фототрофным, хемолитотрофным, грамположительным и грамотрицательным факультативным анаэробам. Однако в большей степени способность к денитрификации распространена у бактерий родов Bacillus и Pseudomonas. Денитрифицирующие бактерии – это обитатели пресных и морских
водоемов, почв разного типа, хотя процесс денитрификации происходит только в анаэр. Усл. (0,2 %).
В качестве конечного акцептора электронов выступает сульфат (SO4), в результате
чего происходит его восстановление до Н2S. Сульфатвосстанавливающие бактерии – строгие анаэробы.
Все сульфатвосстанавливающие бактерии, за исключением представителей двух родов (Desulfotomaculum и Desulfosarcina), имеют клеточную стенку грамотрицательного типа. Среди них есть и одноклеточные, и нитчатые формы. К одноклеточным бактериям относятся представители родов Desulfovibrio и Desulfotomaculum.Нитчатые формы Desulfonema. В качестве источника углерода и энергии сульфатвосстанавливающие бактерии используют, главным образом, органические кислоты, в первую очередь пируват и лактат. Некоторые виды могут потреблять также сукцинат, фумарат, малат. Обнаружена способность использовать жирные кислоты, содержащие от 1 до 12–18 атомов углерода, такие как формиат, ацетат, пропионат, бутират. Отдельные бактерии могут использовать спирты (этанол, пропанол, бутанол), некоторые сахара, циклические и С1-соединения, холин.
У видов Desulfonema limicola и Desulfosarcina variabilis обнаружена способность к автотрофии. Причем эти бактерии используют в качестве источника углерода – СО2, в качестве источника энергии – молекулярный водород, а в качестве конечного акцептора электронов – SO4.
Получение энергии в результате сульфатного дыхания состоит из трех этапов
• отрыва электронов от энергетического субстрата; • переноса их по дыхательной цепи
• присоединения их к веществам, функционирующим в качестве конечных акцепторов электронов.
Цикла Кребса «разорван» и функционирует только в условиях конструктивного метаболизма.
В качестве компонентов дыхательной цепи у сульфатвосстанавающих бактерий идентифицированы флавопротеины, FeS-белки (ферредоксин, рубредоксин), хиноны (типа менахинона), цитохромы b и с. Особен-ностью дыхательной цепи многих сульфатвосстанавливающих бактерий является высокое содержание цитохрома с3. Окисление, в частности Н2, происходит на наружной стороне мембраны, а реакции восстановления SO4 – на внутренней. Последний этап, заключающийся в акцептировании сульфатом электронов с помощью нескольких редуктаз, называется собственно диссимиляционной сульфатредукцией.
У некоторых микроорганизмов, использующих в качестве источника серы сульфаты, происходит ассимиляционная сульфатредукция. При этом происходит восстановление сульфата до сульфида, который затем идет на синтез серосодержащих аминокислот (цистеин, цистин, метионин).
Основные отличия диссимиляционной сульфатредукции от ассимиляционной сводятся к следующему:
• диссимиляционное восстановление сульфата присуще только узкому кругу высокоспец. прокариотических орг-ов;
• активность процессов диссим. намного выше, чем ассимиляционных, следствием чего является накопление больших количеств H2S;
Восстановление сульфата начинается с его активирования с участием АТФ в реакции, катализ. АТФ-зависим.сульфурилазой: SO4+ AТФ + 2Н+= АФС + ФФ
В результате этой реакции образуется аденозинфосфосульфат (АФС) и пирофосфат (ФФ), последний расщепляется пирофосфатазой. Аденозинфосфосульфат с помощью аденозинфосфосульфатредуктазы восстанавливается до сульфита, обр-ся АМФ: АФС+2е-=АМФ+SO3
Восстановление сульфита до сульфида отличается у разных видов
• в первом случае сульфит с пом.сульфитредуктазы прямо восст.до сульфида
• в случае второго механизма происходит последовательное трехступенчатое восстановление сульфита с образованием промежуточных продуктов, таких как тритионат(S3O6) и тиосульфат(S2O3)
Сульфатвосстанавливающие бактерии распространены в анаэробных зонах водоемов разного типа, почвах и пищеварительном тракте животных.
Карбонатное дыхание – процесс окисления молекулярного водорода, при котором конечным акцептором электронов является СО2. Метаногенные бактерии объединены в одну группу на основании
двух общих для всех ее представителей свойств: строгий анаэробиоз и способность образовывать метан. У этой группы прокариот описаны клеточные стенки трех типов:
• остоящие из пептидогликана особого химического строения, получившего название псевдомуреин;
• построенные из белковых глобул; • клеточные стенки гетерополисахаридной природы.
Сложных эфиров, состоящих из глицерина и жирных кислот, у них не обнаружено.
Механизм трансляции нечувствителен к антибиотикам, подавляющим синтез белка у других прокариот.
метаногенные бактерии относят к классу архебактерий.
В качестве источника азота метаногенные бактерии используют аммонийный азот или некоторые аминокислоты. Источником серы могут служить сульфаты, сульфиды или серосодержащие ам-к-ты.
Метаногенные бактерии в основном получают энергию за счет окисления молекулярного водорода в процессах, сопряженных с восстановлением СО2: 4Н2 + СО2 = СН4 + 2Н2О
Многие метаногенные бактерии могут использовать для получения энергии формиат, метанол, ацетат, а также метилированные амины: 4НСООН = СН4 + 3СО2 + 2Н2О, 4СН3ОН = 3СН4 + СО2 + 2Н2О,
4СО + 2Н2О = СН4 + 3СО2, СН3СООН = СН4 + СО2, 4СН3NH3 + 2H2O = 3CH4 + CO2 + 4NH4.
К настоящему времени идентифицирован только один переносчик – кофермент М (КоМ), участвующий на заключительной стадии образования метана. При восстановлении СО2 до метана запасается энергия в форме электрохимического ионного потенциала. Фосфорилирование на субстратном уровне у метаногенных организмов отсутствует.
Обычными местами обитания этих бактерий является анаэробная зона водоемов, богатых органическими соединениями, иловые отложения озер и рек, болота, заболоченные почвы, осадочные слои морей и океанов. Метаногенные бактерии – типичные обитатели пищеварительного тракта и важный компонент микрофлоры рубца жвачных.
Фумаратное дыхание: во-первых, это единственный пример анаэробного дыхания, когда роль конечного акцептора электронов в дыхательной цепи играет органическое вещество (фумаровая кислота); во-вторых, этот тип получения энергии не является единственно возможным для какой-либо определенной таксономической группы бактерий(хемоорганотрофы, которые обладают также способностью к брожению). Восстановление фумарата в бактериальных клетках часто сопровождается образованием сукцината (Bacteroides, Fibrobacter, Wolinella). Кроме сукциногенных бактерий, к фумаратному дыханию способны многие другие хемоорганотрофы (энтеробактерии (роды Escherichia, Proteus,
Salmonella, Klebsiella и др.), представителей рода Propionibacterium). пропионовокислые бактерии в ходе брожения осуществляют этап фумаратного дыхания.
- Взаимотношения микро и макроорганизмов.
Тесное сожительство микроорганизмов с растениями и животными в широком смысле называется симбиозом. При длительном сосуществовании между микро- и макроорганизмом происходит процесс их совместной коэволюции. Особенностью симбиозов следует считать также общий поток энергии, совместную регуляцию экспрессии генов и наличие взаимной передачи физиологической, клеточной, организменной информации через различные регуляторные системы.
• мутуализм или взаимовыгодный симбиоз; • паразитизм – один из партнеров по симбиозу испытывает вредное воздействие другого; • комменсализм – микроорганизмы питаются за счет своего хозяина,
не нанося ему особого ущерба. Если микроорганизм находится вне клеток макроорганизма, то говорят об экзосимбиозе, а если внутри клеток и тканей – об эндосимбиозе. Макроорганизм обычно называют хозяином.
Одним из них является симбиоз клубеньковых бактерий с бобовыми растениями. Одним из примеров взаимовыгодных экзосимбиозов является симбиоз микроорганизмов и жвачных животных. Два первых, называемых рубцом, содержат большое количество микроорганизмов. Микрофлора рубца очень разнообразна и представлена пектолитическими, молочнокислыми, метаногенными, пропионовокислыми, маслянокислыми, целлюлолитическими бактериями, простейшими, микроскопическими грибами. Во-первых, они обеспечены питательной средой, которая в изобилии содержит сбраживаемые углеводы и хорошо забуферена слюной; во-вторых, они находятся в ус-
ловиях постоянной благоприятной температуры – температуры тела животного; в-третьих, в желудке поддерживаются оптимальные условия влажности; в-четвертых, осуществляется постоянное перемешивание субстрата и отток непереваренных остатков корма и метаболитов в ни-жележащие отделы пищеварительного тракта. Микроорганизмы рубца расщепляют целлюлозу и другие сложные углеводы, присутствующие в поглощенном животным корме, образуя жирные кислоты (сукцинат, лактат, пропионат, бутират) и газы (СО2 и СН4).
На поверхности надземной части растений (в филлосфере) всегда находится большое количество бактерий и грибов, получивших название эпифитных (Pantoea agglomerans, молочнокислых
Бактерий).
Примером мутуалистических экзосимбиозов является также формирование и развитие нормальной микрофлоры человека, млекопитающих и других животных. Роль нормальной микрофлоры в организме сводится к следующему. 1. Выполняет важную роль в защите организма от патогенов. 2. Активирует иммунную систему.3. Обеспечивает макроорганизм ионами Fe2+, Ca2+ и витаминами. 4. Участвует в инактивации токсичных продуктов, проникающих из-вне и/или образующихся эндогенно. 5. Участвует в процессах пищеварения, в том числе в обмене холестерина и желчных кислот. Патогенность – важное в таксономическом отношении свойство, поскольку оно является видовым признаком и качественной характеристикой болезнетворного микроорганизма. Вирулентность является количественным проявлением патогенности. Самым важным фактором вирулентности является способность микробов синтезировать ядовитые продукты метаболизма – токсины.
- Питательные среды в микробиологии.
Питательной средой в микробиологии называют среды, содержащие различные соединения сложного или простого состава, которые применяются для размножения микроорганизмов в лабораторных или
промышленных условиях. Любая питательная среда должна соответствовать следующим
требованиям: содержать все необходимые для роста питательные вещества в легко усвояемой форме; иметь оптимальную влажность, вязкость, рН, быть изотоничной, сбалансированной с высокой буферной
емкостью и, по возможности, прозрачной. Вещества, которые клетки не в состоянии синтезировать самостоятельно – наз-ся факторами роста. Организмы, которые нуждаются в их добавлении н-ся ауксотрофными по соответствующим соединениям. Группа способная к росту на простых средах, прототрофных. Олиготрорфные (на бедных),противоположную группу для них составляют бактерии копиотрофные – способные к росту на богатых пищевых субстратах.
По составу питательные среды делятся на натуральные и синтетические. Натуральными называют среды, которые состоят из продуктов растительного или животного происхождения, имеющих неопределенный химический состав. Примерами - смесь продуктов распада белков образующихся при их гидролизе. Действие ферментов типа трипсина, панкреатина,папаина, приводит лишь к частичному (неполному) гидролизу белков,в результате чего образуются пептоны. Основное назначение таких питательных сред – выделение, культивирование, получение биомассы и поддержание культур.
К числу сред неопределенного состава относят и среды полусинтетические. В такую среду вносят известные соединения как явно необходимые; а также добавляют небольшое количество дрожжевого иликукурузного экстракта (или любого другого природного продукта) дляобеспечения неизвестных потребностей роста. Такие среды часто используются в случае промышленного культивирования биологическихобъектов для получения продуктов метаболизма.
Синтетические среды – это среды определенного состава, представленные чистыми химическими соединениями, взятыми в точноуказанных концентрациях и соотношениях отдельных элементов.
Основное назначение таких питательных сред – изучение особенностей физиологии и метаболизма
микроорганизмов, выделение генетических рекомбинантов и т. д.
По назначению: Элективные среды обеспечивают развитие одного или целой физиологической группы микроорг-ов. Дифференциально-диагностические среды применяются для быстрой идентификации близкородственных видов микроорг-ов, дляопределения видовой принадлежности, в клинической бактериологиии. Принцип построения диффер.-диагностич.сред основан на том, что разные виды бактерий различаются между собойпо биохимической активности и имеют неодинаковый набор ферментов, расщепляющих субстраты, входящие в состав питательной среды.
В состав д.-д. входят: а) основная питательная среда, обеспечивающая размножение бактерий; б) определенный химический субстрат, отношение к которому является диагностическим признаком для данного микроорганизма; в) цветной индикатор, изменение окраски которого свидетельствует о биохимической реакции и наличии данной ферментной системы у исследуемого микроорганизма.
По консистенции среды могут быть жидкими, полужидкими, твердыми, сыпучими. Жидкие получают прирастворении в воде определенного необходимого набора питательных в -в, макро- и микроэлементов. Рост микроорганизмов в жидкой среде может происходить в периодической (закрытой) системе, в этом случае после инокуляции среды не происходит ни добавления, ни удаления каких-либо компонентов, кроме газовой фазы. При проточном (непрерывном) культивировании характерна постоянная подача свежих питательных компонентов со скоростью, равной скорости удаления среды (открытая система). Приготовление твердых сред достигается добавлением к жидким средам определенных уплотнителей (агар, желатина, силикагель, каррагенан). Сыпучие среды применяют в промышленной микробиологии для культивирования некоторых продуцентов физиологически активных соединений. К таким средам относятся, н-р, разваренное пшено, отруби.
В состав среды Гисса входит основной фон (пептон и K2HPO4), индикатор (бромтимоловый синий, бромкрезоловый пурпурный, Андреде) и один из изучаемых углеводов или спиртов. Различают малый и
большой пестрый ряд Гисса. В малый ряд Гисса входят следующие углеводы и спирты: глюкоза, сахароза, лактоза, мальтоза и маннит. В большой пестрый ряд Гисса входят, кроме тех, что образуют малый ряд, другие углеводы и спирты, например арабиноза, рамноза, сорбит, дульцит и т. д. Среды Гисса можно использовать в жидком или полужидком состоянии (к жидк.среде добавляют 0,5 % агара)
Выделение продуктов обмена регистрируется по изменению рН среды. Н-р, если среда Гисса содержит индикатор бромтимоловый синий, то цвет ее будет изменяться в зависимости от рН следующим образом: рН = 7,0 – зеленый; рН > 7,0 – синий; рН < 7,0 – желтый.
Билет 21.
- Пропионовокислое брожение.
Основным продуктом является пропионовая кислота. Кроме нее, синтез-ся уксусная кислота и СО2. Пропионовокислые бактерии расщепляют углеводы по гликолитическому пути до пировиноградной кислоты, которая подвергается дальнейшим превращениям с образованием пропионовой кислоты,
уксусной кислоты и СО2: 1,5Глюкоза= 2Пропионат + СО2 + Ацетат
Поскольку пропионовокислые бактерии развиваются, в тех же субстратах, что и молочнокислые (рубец и кишечник жвачных животных), то предпочтительным субстратом для окисления является молочная кислота, синтезирующаяся в результате молочнокисл. брожения: 3Лактат = 2Пропионат + Ацетат + СО2
Существуют два метаболических пути образования пропионовой кислоты у пропионовокислых:
• акрилатный путь, в котором лактат в ходе ряда последовательных реакций восс-ся до пропионата;
• сукцинат-пропионатный,в кот. лактат превр-ся в пропионат через стадии обр-ия пирувата и сукцината.
Акрилатный путь (Clostridium propionicum, Bacteroides ruminicola, Megasphaera
elsdenii). Субстратами для данного метаболического пути могут служить L-, D-, или LD-формы лактата. В клетках - фермент рацемаза, катализирующий взаимопревращения стереоизомеров: L-лактат превращается в L-лактил-КоА, который в результате реакций превращается в акрилоил-КоА. В свою очередь акрилоил-КоА восстанавливается до пропионил-КоА с дальнейшим образованием пропионата.
Кроме пропионата, в акрилатном типе брожения образуются также ацетат и СО2. Выход АТФ составляет одну молекулу на три молекулы потребленного в этом случае лактата.
Сукцинат-пропионатный функционирует у большинства микроорганизмов, образующих пропионат. Сукцинат в этом пути синтезируется как промежуточный продукт, но может продуцироваться также в качестве конечного продукта в малых или больших количествах.
Этот тип брожения называют еще метилмалонил-КоА-путем, потому что в нем образуется характерный промежуточный продукт – метилмалонил-КоА.
Исходным соединением при функционировании этого типа брожения является лактат, который окисляется до ПВК. На следующем этапе происходит карбоксилирование ПВК с участием фермента метилмалонил-КоА-карбокситрансферазы и комплекса СО2 ~ биотин. Синтезируемый в реакции оксалоацетат восстанавливается до сукцината с образованием промежуточных продуктов малата и фумарата. На этапе превращения фумарата в сукцинат происходит субстратное фосфорилирование, в ре-зультате чего образуется молекула АТФ. Затем сукцинат при участии фермента КоА-трансферазы присоединяется к КоА и активируется, образуя сукцинил-КоА. Последний под действием метилмалонил-КоА-мутазы и при участии кофактора В12 превращается в метилмалонил-КоА, по-
сле декарбоксилирования которого образуется пропионил-КоА. Молекула СО2 связывается с метилмалонил-КоА-карбокситрансферазой, что вновь приводит к образованию комплекса СО2 ~ биотин. Синтез пропионата происходит в результате реакции переноса КоА от пропионил-КоА
на сукцинат при участии фермента КоА-трансферазы. Таким образом, в процессе образования пропионата КоА и СО2 переносятся с последующего продукта на предшествующий, не освобождаясь. Следует отметить, что в этом процессе участвуют три кофактора (биотин, КоА и кофермент В12).
Пропионовокислое брожение используется в сыроделии при созревании твердых сыров, которое длится два-три месяца(сычужный фермент – водный экстракт телячьих желудков).
Род Propionibacterium,кот. входит в состав сем-ва Propionibacteriaceae.
В целом пропионовокислые бактерии характеризуются как грамположительные, каталазоположительные, неспорообразующие, неподвижные, факультативные анаэробы или аэротолератные. Клетки часто булавовидной формы с одним концом закругленным и другим суженным; некоторые клетки могут быть кокковидными, раздвоенными или разветвленными, но нитчатые формы отсутствуют.К классическим пропионовокислым бактериям относятся четыре вида: P. freudenreichii, P. thoenii, P. jensenii, P. acidipropionici. К кожным пропионовокислым бактериям относятся три вида: P. acnes, P. avidum, P. granulosum. Типовой вид – Propionibacterium freudenreichii.
- Плазмиды бактериальных клеток. Природа, виды и использование.
Наряду с хромосомой в бактериальной клетке могут присутствовать плазмиды – стабильно наследуемые внехромосомные генетические элементы.
В большинстве случаев плазмиды бактерий представляют собой двухцепочечные суперскрученные ковалентнозамкнутые кольцевые молекулы ДНК. Существуют также линейные плазмиды, на которые
нуклеазы не действуют, поскольку их концевые участки защищены специфическими белками. У некоторых плазмид имеется теломероподобные концы, в которых соединяются ковалентнозамкнутые двухцепочечные ДНК. Ферменты, уч-щие в замыкании таких концов плазмид, наз-ся теломеразами.
Плазмиды не являются жизненно важными структурами бактериальной клетки.
Одним из основных свойств плазмид является способность к автономной репликации (сайт начала репликации – ori и набор генов, необходимых для ее осуществления). Плазмиды со строгим контролем репликации удваиваются синхронно с бактериальной хромосомой и за счет использования одних и тех же репликативных комплексов, в которых главную роль играет ДНК-полимераза III. Таких плазмид в бактериальной клетке может насчитываться от одной до трех копий в расчете на одну копию бактериальной хромосомы молек.масса которых превышает 20 МД. Репликация плазмид с ослабленным контролем происходит с участием ДНК-полимеразы I. В каждой бактериальной клетке содержится в среднем 40–50 копий таких плазмид. В связи с этим плазмиды с ослабленн. контролем репл-ции еще наз. мультикопийными. Молек.м. не более 15–20 МД.
Способность передаваться из клетки в клетку при конъюгации, или трансмиссивность. Конъюгативные плазмиды способны передаваться из одной клетки в другую, их молекулярная масса обычно превышает 25 МД и они имеют гены, ответственные за перенос (tra-гены), объединенные в tra-опероны. Гены tra-оперонов детерминируют ряд свойств: синтез половых пилей, которые необходимы для образования конъюгативных пар; сам перенос ДНК и постконъюгативный синтез ДНК, что придает клетке донорные свойства. Плазмиды с широким кругом клеток-хозяев называются космополитными или промискуитетными. Н-р.RP4. Неконъюгативные плазмиды не содержат tra-генов,и поэтому они неспособны самостоятельно передаваться от одних клеток к другим. Неконъюгативные плазмиды – это мелкие плазмиды с молекулярной массой менее 25 МД. Однако неконъюгативные плазмиды могут быть перенесены в реципиентные клетки с помощью конъюгативных плазмид. Перенос неконъюгативных плазмид с помощью конъюгативных называется мобилизацией. При этом неконъюгативная плазмида является мобилизуемой, а конъюгативная – мобилизующей. Мобилизация может осуществляться из-за наличия в плазмидах IS-элементов и транспозонов, которые обеспечивают объединение двух плазмид друг с другом, т. е. образование коинтегратов. В реципиентных клетках коинтеграты распадаются на два. Плазмиды, которые могут находиться как в автономном, так и в интегрированном состоянии по отношению к хромосоме клетки-хозяина, получили название эписом. При интеграции конъюгативной плазмиды в хромосому образуются доноры типа Hfr, способные с высокой частотой передавать хромосомные гены в клетки реципиента. Свойство плазмид - несовместимость. Родственные плазмиды не могут сосуществовать в одной клетке, поскольку они несовместимы. Несовместимость плазмид обусловливается или блокированием репликации ДНК родственной плазмиды, или блокированием распределения дочерних молекул ДНК по клеткам. Конъюгативным плазмидам присуще еще одно свойство – поверхностное исключение, приводящее к тому, что при наличии в клетке плазмиды определенного типа, контролирующей соответствующий признак, при конъюгации другая плазмидная ДНК с трудом преодолевает барьер клеточной стенки. Плазмиды придают клеткам различные фенотипические признаки: 1) устойчивость к антибиотикам, ионам тяжелых металлов, мутагенам (R-плазмиды); 2) способность вызывать биодеградацию камфоры, ксилола, нафталина, салицилата, толуола, n-алканов и соединений (ксенобиотиков). Плазмиды биодеградации или D-плазмиды;
3) способность синтезировать антибиотики, бактериоцины, пигменты, инсектициды, гемолизины, токсины, фибринолизины, сероводород, поверхностные антигены; 4) способность использовать в качестве источника углерода различные углеводы и необычные аминокислоты;
5) способность вызывать образование опухолей у растений (Ti-плазмиды);
6) способность конъюгировать с реципиентными штаммами бактерий или донорные свойства;
7) способность осуществлять рестрикцию и модификацию ДНК и др.
Однако существует большое количество плазмид, фенотипические свойства которых неизвестны, такие плазмиды получили название криптических.
F плазмида представляет собой конъюгативную эписому клеток E. coli K-12 со строгим контролем репликации. Размер ее кольцевой ДНК составляет 94,5 т. п. н. Попадая в F–-клетки, эта плазмида изменяет их фенотипические свойства и клетки приобретают половые пили, а также чувствительность
к фагам MS2, f1, f2, Q., становятся донорами ДНК, перестают поддерживать развитие фагов Т3 и Т7. При конъюгации таких клеток блокируется проникновение в них донорной ДНК (проявляется свойство поверхностного исключения). За конъюгативные свойства F-плазмиды отвечает tra-область, в которую входят 24 гена, сгруппированные в три оперона. Автономную репликацию F-плазмиды детерминируют rep-гены. За распределение моле-кул плазмидной ДНК по дочерним клеткам отвечают гены области par,
вблизи которой находится ген pif, обеспечивающий исключение развития в клетке фагов Т3 и Т7. Структурными компонентами, с помощью которых осуществляется интеграция F-плазмиды в бактериальную хромосому, являются элементы IS2, IS3 и Тn1000. Клетка после интеграции в ее ДНК F-плазмиды приобретает свойства Hfr-клетки и способна с высокой частотой ориентированно передавать генетический материал в реципиентные клетки. F-плазмида, интегрированная в хромосому, может из нее исключаться. При неправильном исключении F-плазмиды образуется F’-плазмида, т. е. F-плазмида, содержащая в своем составе гены бактериальной хромосомы.
Плазмида ColE1 относится к классу неконъюгативных плазмид с ослабленным контролем репликации. Размер плазмиды ColE1 равен 6,65 т. п. н. В составе плазмиды содержится сайт ori, с которого начина-
ется однонаправленная репликация, гены сеа, отвечающие за синтез колицина Е1, гены imm, обеспечивающие клетке иммунитет к действию этого колицина, а также ген kil, детерменирующий синтез белка, который вносит нарушения в структуру внешней мембраны, что обусловливает освобождение колицина Е1 из бактерий в окружающую среду без разрушения клеток. Ген rop регулирует количество копий плазмиды в клетке. Синтез колицина в норме репрессирован, но индуцируется агентами, влияющими на ДНК. Плазмида СolЕ1 при наличии в клетке конъюгативной плазмиды может передаваться в реципиентные клетки, т. е. происходит ее мобилизация. У плазмиды СolЕ1 за процесс мобилизации отвечают четыре белка, кодируемые областью mob (mobilization).
Образование коинтеграта между плазмидой СolЕ1 и конъюгативной плазмидой не происходит, так как плазмида СolЕ1 не имеет в своем составе ни IS-элементов, ни транспозонов. При
такой мобилизации перенос конъюгативной плазмиды в реципиентную
клетку может и не происходить.
R-плазмиды представляют собой двухцепочечные кольцевые молекулы ДНК. Молекулярная масса R-плазмид различна – от 3 до 300 МД. Большая часть известных R-плазмид клинических изолятов грамотрицательных бактерий конъюгативна, у грамположительных штаммов выделяют как конъюгативные, так и неконъюгативные R-плазмиды.
Плазмиды резистентности могут контролировать устойчивость к одному или нескольким антибиотикам.
Первая группа – гены, ответственные за передачу плазмиды путем конъюгации (гены tra), они образуют так называемый «фактор переноса устойчивости» (RTF, resistense transfer factor). Область RTF по своей молекулярной структуре гомологична tra-оперону F-фактора E. coli. Вторая группа – гены, обусловливающие собственно резистентность (r-det).
Ti-плазмиды. Эти плазмиды обнаружены в клетках вирулентных штаммов бактерий Agrobacterium tumefaciens, вызывающих раковое заболевание растений, получившее название «корончатый галл».
Ti-плазмиды – кольцевые молекулы ДНК длиной до 500 т. п. н. и молек.м. в среднем 1,3·108 Д. Относятся к классу конъюгативных плазмид. Т-ДНК, встраивается в хромосому инфицируемого растения. В таком состоянии Т-ДНК вызывает образование опухоли, гиперпродукцию фитогормонов, а также синтез ряда производных аминокислот, которые называются опинами. Опины, выделяемые клетками опухоли, бактерии используют в качестве источников углерода и азота.
- Техника окраски по Грамму.
1884 г. датским ученым Х. Грамом. Этот метод основан на различной способности микроорганизмов удерживать в клетке красители трифенилметанового ряда – кристаллический фиолетовый или генциановый фиолетовый.
Окраска по методу Грама является самым универсальным из сложных методов окраски.
1. Фикс. мазок покрывают фильтрю бум. и на него наносят карболовый раствор генцианового фиолетового. Окрашивание проводят на протяжении 1 – 2 мин.2. Бумажку снимают, краситель сливают и, не промывая препарат водой, обрабатывают его на протяжении 1 – 2 мин раствором Люголя до почернения.3. Сливают раствор Люголя, окрашенный мазок обесцвечивают 96ºэтиловым спиртом не более 30 с.4. Препарат промывают водой.5. Мазок дополнительно окрашивают на протяжении 1 – 2 мин
водным раствором фуксина.6. Краситель сливают, препарат промывают водой, высушивают
фильровальной бумагой и микроскопируют с иммерсионной систе-
мой. Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый
