Билет 29.
- Аэробное дыхание. Синтез АТФ. Цепи.
ПВК, окисляется с участием коэнзима А до ацетил-КоА. В данном процессе работают ферменты пируватдегидрогеназы: CH3–CO–COOH + KoA–SH + HAД+ = CH3–CO~KoA + НАД · Н2 + CO2
Ацетил-КоА является исходным субстратом цикла трикарбоновых кислот (ЦТК), или цикла Кребса.
В цикл Кребса включается одна молекула ацетил-КоА, которая в реакции с оксалоацетатом, катализируемой цитратсинтетазой, приводит к образованию лимонной кислоты и свободн. коэнзимаА. Лимонная кислота с помощью фермента аконитазы превращается в цис-акотиновую и изолимонную кислоты. Изолимонная кислота через щавелевоянтарную кислоту превращается в а-кетоглутаровую кислоту, которая подвергается дальнейшему декарбоксилированию.
В конечном итоге - двух молекул СО2, одной молекулы АТФ и 8 атомов водорода, из которых шесть атомов связаны в молекулах пиридиннуклеотидов и два атома – в молекулах флавопротеинов.
У некоторых бактерий цикл трикарбоновых кислот «разорван». Наиболее часто отсутствует этап превращения а-кетоглутаровой кислоты в янтарную. В таком виде ЦТК не может функционировать в системе энергодающих реакций клетки. Основная функция «разорванного» ЦТК – биосинтетическая.
Образовавшиеся на разных этапах окисления органических веществ НАДН2 и ФАДН2, поступают в дыхательную цепь, которая у бактерий находится в цитоплазматической мембране. Они вновь окисляются до НАД и ФАД, а отщепившийся от них водород передается не менее чем через пять переносчиков на заключительный участок цепи, где соединяется с молекук.кислородом, образуя воду.
Транспорт водорода сопровождается протеканием ряда окислительно-восстановительных реакции- образ.АТФ - окислительного фосфорилирования.
Флавопротеины – коферменты, в состав которых входит витамин В2, а в качестве простетических групп в них выступают флавинмононуклеотид (ФМН) или флавинадениндинуклеотид (ФАД). Флавопротеины осуществляют перенос атомов водорода, т. е. являются дегидрогеназами. Дегидрогеназа, содержащая в качестве простетической группы ФМН, яв- ляется НАДФН2-дегидрогеназой. Это стартовый переносчик в дыхательной цепи, осуществляющей перенос водорода с НАДФН2 на следующие компоненты дыхательной цепи. Дегидрогеназа, содержащая в качестве простетической группы ФАД, действует как сукцинатдегидрогеназа. Она катализирует окисление янтарной кислоты в фумаровую в ЦТК. Атомы водорода от ФАДН2 поступают сразу на хиноны, локализ. на последних этапах электронтрансп.ц.
Железосерные белки (FeS-белки) содержат железосероцентры, в которых атомы железа связаны, с одной стороны, с серой аминокислоты цистеина, а с другой – с неорганической сульфидной серой.
Железосероцентры входят в состав некоторых флавопротеинов или же служат в качестве единственных простетических групп белков. Железосероцентры в зависимости от строения могут осуществлять одновременный перенос одного или двух электронов, что связано с изменением валент. атомов железа.
Хиноны – жирорастворимые соединения. У грамотрицательных бактерий они представлены убихиноном (кофермент Q) или менахиноном
Хиноны липофильны, и поэтому локализуются в липидной фазе мембраны. Они переносят атомы водорода. Они служат «сборщиками» водорода, поставляемого различными коферментами и простетическими группами в дыхательной цепи, и передают его цитохромам.
Цитохромы принимают участие на заключительном этапе в цепи переноса электронов. К ним электроны поступают от хинонов. В качестве простетической группы цитохромы содержат гем. Цитохромы окра-
шены; они отличаются друг от друга спектрами поглощения и окислительно-восстановительными потенциалами. Широко распространен цитохром с. Конечные (терминальные) цитохромы дыхательной цепи – это цитохромы а + а3 или цитохромоксидаза. Они передают электроны на молекулярный
кислород, т. е. катализируют восстановление молекулярного кислорода до воды. В реакционном центре цитохромоксидазы, помимо двух гемов, содержатся два атома меди.
Флавопротеины и хиноны осуществляют перенос атомов водорода, а FeS-белки и цитохромы – электронов.
у дрожжей: • комплекс 1 – НАД Н2-дегидрогеназа; в него входят ФМН и железосерные белки; НАД Н2-дегидрогеназа переносит водород от НАДН2 к коферменту Q; • комплекс 2 – сукцинатдегидрогеназа, содержащая ФАД. Она отдает водород в дыхательную цепь на уровне кофермента Q; • комплекс 3 – цитохром b и цитохром с1, принимающие электроны от кофермента Q и передающие их на цитохром с; • комплекс 4 –цитохромоксидаза, осуществляющая перенос электронов на молекулярный кислород.
Дых. цепь бактерий E. coli: - в нее не входит цитохром с; - дых. цепь у E. coli разветвлена.
В клетках, растущих в условиях достаточной аэрации, восстановительные эквиваленты передаются к кислороду преимущественно через кофермент Q, цитохром b556 и цитохром о. При ограниченном снабжении кислородом клетки используют в качестве переносчиков электронов менахинон или убихинон и цитохромы b558 и d. В последнем случае обр-ся меньшее АТФ.
У дрожжей существуют 3 пункта фосфорилирования, которые соответствуют участкам
выхода протонов во внешнюю среду. Первый участок локализован в на-чале дыхательной цепи и связан с функционированием НАДФН2-дегидрогеназы. Второй определяется способностью убихинона переносить водород. Последний локализован в конце цепи и связан с активностью цитохромоксидазы.
Так как внутренняя мембрана митохондрий и цитоплазматическая мембрана бактерий непроницаемы для ионов, в том числе и для Н+, и ОН–, то создается трансмембранный электрохимический, или протонный градиент между наружной и внутренней их сторонами. Протоны могут обратно поступать
через мембрану только в определенных местах. В них располагаются АТФ-синтазы.
Установлено, что синтез молекулы АТФ связан с переносом двух протонов через комплекс АТФ-синтазы. При окислении НАДН2 молек. кислородом выделяется 6 протонов,макс.выход АТФ =3.
• в процессе гликолиза образуются 2 АТФ, 2 НАДН2 и 2пирувата; • при окислительном декарбоксилировании 2 пирувата образуются 2 ацетил-КоА и 2 НАДН2; • окисление 2 ацетил-КоА в цикле Кребса приводит к образованию 6 НАДН2, 2 ФАДН2 и 2 АТФ. НАДН2 - 3 АТФ, ФАДН2 – 2 АТФ.Суммарный энергетический выход С6Н12О6 + 6О2 + 38АДФ + 38Н3РО4 6СО2 + 38АТФ + 44Н2О
E. coli. Имеются только два пункта, в которых происходит «выброс» протонов.Следовательно, при окислении одной молекулы НАДН2 образуются только 2 АТФ, а при окисл. молекулы ФАДН2 – 1 АТФ. E. coli 26 молекул АТФ: • 2 АТФ синтезируются в гликолизе; • 2 АТФ синтезируются в двух оборотах цикла Кребса; • 10 молекул НАДН2 приводят к синтезу 20 молекул АТФ; • 2 ФАДН2=2 АТФ.
Corynebacterium diphtheriae имеется только один пункт «выброса» протонов. У Mycobacterium phlei – 3.
- Спорообразующие бактерии.
В эту группу входят бактерии разной морфологи, большинство из них окрашивается по Граму положительно. Клетки обычно подвижные за счет перитрихиальных жгутиков, образуют устойчивые к нагреванию, сильно преломляющие свет эндоспоры. В группу входят пять основных родов: Bacillus,
Sporosarcina, Sporolactobacillus, Clostridium и Desulfotomaculum.
Первичное таксономическое деление основано на отношении к молекулярному кислороду. Роды Bacillus и Sporosarcina - облигатные аэробны и факультативные анаэробы. Представители рода Bacillus – грамположительные палочковидные, рода Sporosarcina – грамположительные кокковидные бактерии.
Представители родов Clostridium и Desulfotomaculum являются облигатными анаэробами. Бактерии рода Clostridium окрашиваются по Граму положительно и синтезируют энергию в основном за счет брожения. Бактерии рода Desulfotomaculum по Граму окрашиваются отрицательно, хотя имеют клеточную стенку грамположительного типа, энергию получают путем анаэробного сульфатного дыхания. Бактерии рода Sporolactobacillus – микроаэрофилы. Клетки палочковидные, подвижные, грамположительные. Метаболизм бродильный, осуществляют гомоферментативное молочнокислое сбраживание гексоз с образованием молочной кислоты. Клетки не содержат каталазы и цитохромов. Типовой (и единственный) вид Sporolactobacillus inulinus.
Наиболее широко распространенных относятся бактерии родов Bacillus и Clostridium.
К роду Bacillus относятся аэробные или факультативно-анаэробные палочковидные бактерии, большинство из них подвижны. Хемоорганотрофы. Метаболизм строго дыхательный, строго бродильный или дыхательный и бродильный одновременно. Некоторые способны получать энергию за счет нитратного дыхания. Для большинства характерно брожение с образованием 2,3-бутандиола, глицерина и СО2, а также небольших количеств молочной кислоты и этанола. Можно разделить на три группы, по структуре и внутриклеточной локализации эндоспор:
1. Споры овальные, расположение их в материнской клетке централь-ное, растяжение клетки спорой не происходит. У большинства бацилл (B. subtilis, B. cereus, B. megaterium, B. anthracis, B. thuringiensis).
2. Споры овальные, имеющие толстую оболочку с выростами, расположение их в материнской клетке центральное. Они «растягивают» клетки изнутри (B. polymyxa, B. stearothermophilus).
3. Споры сферические, расположение полярное. Эндоспоры «растягивают» кл-ку (B. pasteurii).
Большинство являются сапрофитами, широко распространены в природе, особенно в почвах, богатых органическими веществами (B. subtilis, B. megaterium, B. polymyxa, B. stearothermophilus). B. megaterium считаются «гигантами» среди эубактерий 2. 5 мкм. Вид B. subtilis называется «сенной палочкой».
Представителями патогенных бацилл являются B. anthracis и B. thuringiensis. B. anthracis – возбудитель сибирской язвы (нуждающиеся в факторах роста неподвижные бактерии с пептидной капсулой, содержащей в большом количестве D- и L-формы глутаминовой кислоты). B. thuringiensis – возбудитель паралитического заболевания у гусениц многих чешуекрылых насекомых. Каждая спорулирующая клетка бактерий B. thuringiensis образует примыкающий к споре кристалл, состоящий из Cry-белков или из Cyt-белков. Специфичность действия Cry-белков очень высока.
Бактерии рода Bacillus являются активными продуцентами антибиотических веществ(полимиксины, колистин, бацитрацин). B. subtilis – для них описано более 70 различных антибиотиков. B. Brevis, B. polymyxa, B. cereus, B. circulans, B. megaterium. Большинство антибиотиков – полипептиды, против грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также дрожжей и микроскопических грибов. Антибиотик бутирозин, продуцируемый бактериями B. circulans, является аминогликозидом, а антибиотик протицин бактерий B. licheniformis – фосфосодержащим триеном.
Анаэробные спорообразующие бактерии рода Clostridium – палочки с закругленными концами, часто расположенные в парах или коротких цепочках. Большинство из них. Образуют овальные или сферические эндоспоры, располагающиеся субтерминально, центрально или терминально. Как правило, диаметр спор больше диаметра вегетативной клетки. Большинство штаммов рода Clostridium – облигатные анаэробы, хотя некоторые могут расти в присутствии воздуха. Хемоорганотрофы, энергию получают в основном за счет маслянокислого брожения. Возбудителями классического маслянокислого брожения являются C. butyricum, C. pasteurianum, C. rubrum. В качестве основных продуктов они образуют масляную и уксусную кислоты, углекислый газ и молекулярный водород. Другие (C. acetobutyricum, C. felsineum, C. sporogenes) осуществляют ацетонобутиловое брожение, кроме масляной кислоты образуются нейтральные продукты: ацетон, бутиловый, этиловый, изопропиловый спирты.
Сбраживают большое число субстратов, включая полисахариды, белки, аминокислоты и пурины. В зависимости от вида сбраживаемого субстрата:
• сахаролитические, использующие в качестве субстратов моносахара, крахмал, пектин, целлюлозу и другие вещества углеводной природы (C. pasteurianum, C. butyricum, C. acetobutyricum, C. felsineum);
• протеолитические, сбраживающие белки, пептиды, аминокислоты (C. botulinum, C. tetani, C. putribicum, C. sporogenes, C. histolyticum и др.);
• пуринолитические, сбраживающие гетероциклические азотсодержащие соединения – пурины и пиримидины (C. acidiurici, C. cylindrosporum).
Для них выявлена потребность в определенных витаминах и наборе аминокислот. Для многих сахаролитических клостридий характерна способность фиксировать атмосферный азот. Естественной средой их обитания является почва, особенно ее глубокие слои, ил различных водоемов, сточные воды, кишечный тракт травоядных животных и человека. К сапрофитным относятся C. pasteurianum, C. acetobutyricum, C. butyricum (типовой вид). Патогенные клостридии: C. tetani – возбудитель столбняка; C. botulinum – возбудитель ботулизма; C. histolyticum, C. septicum, C. perfringens, C. novyi, C. sordelli – возбудители газовой гангрены. Патогенные клостридии, как правило, относятся к протеолитическим.
- Изучение выживаемости бактерий под действием УФ.
В диапазоне от 4000 до 10 Å говорят об ультрафиолетовых лучах, а в диапазоне от 10 до 0,1 Å – об ионизирующем излучении. УФ-свет и ионизирующее излучение поглощаются ДНК клетки, в которой они вызывают различные нарушения. Ионизирующие излучения индуцируют в молекулах ДНК одно- и двунитевые разрывы углеводно-фосфатных цепей и изменения азотистых оснований. Основными фотопродуктами в ДНК после действия УФ-лучей являются циклобутановые димеры тиминовых оснований, располагающиеся в одной нити. Наибольший летальный эффект УФ-лучей наблюдается при длине волны 260 нм, при которой отмечается максимум поглощения УФ-лучей молекулами ДНК.
1. При оценке большое значение имеет плотность изучаемой бактериальной взвеси. УФ-лучи интенсивно поглощаются бактериальной клеткой, а при высокой концентрации клетки могут экранировать друг друга (превышающих 108 кл/мл).
2. Выживаемость клеток зависит от состава среды. Лучше проводить облучение в буфер. растворах.
3. Летальный эффект УФ-лучей зависит также от физиологического состояния клеток.
Для эксперимента необходима культура бактерий, находящихся в экспоненциальной стадии роста.
Культуру разводят в 10 раз жидкой полноценной питательной средой и инкубируют еще 2 часа на качалке. Затем бактериальные клетки отмывают и ресуспендируют физиол.р-ре.Облучение культуры осуществляют в открытых чашках Петри в течение заданного времени (30, 60, 90, 120 и 240 с) на расстоянии от источника 40 см. Для каждой дозы используют отдельную чашку, в которую наливают по 5 мл взвеси. Во время облучения содержимое чашек перемешивают. Для определения количества жизнеспособных клеток отбирают пробы по 0,5 мл из контрольной и 5-ти облученных взвесей и после серии десятикратных разведений в физиол. Р-ре из последних разведений проводят высевы на поверхность агаризованной полноценной питательной среды в двух чашках Петри. Количество колоний подсчитывают, определяют титр клеток и выживаемость облученных УФ-светом клетокв процентах от контроля. По оси абсцисс откладывают время облучения, по оси ординат выживаемость в процентах.
Билет 18.
- Изменчивость. Доказательство мутационной природы.
Термин «мутация» введен Г. Де Фризом (1901), изучавшим изменчивость и наследственность у растений и определившим мутацию как «скачкообразное изменение наследственного признака». Это понятие М. Бейеринк позднее распространил и на бактерии. Мутация – событие редкое ипроисходит с частотой 1·10–4–1·10–10.У бактерий мутации носят спонтанный и ненаправленный характер.
В 1943 г. С. Лурия и М. Дельбрюк доказали спонтанное возникновение мутантов бактерий с помощью флуктуационного теста. В эксперименте с участием бактериофага Т1, обладающего высокой вирулентностью в отношении бактерий E. coli, исследовался процесс возникновения резистентности у данных бактерий к фагу. Принцип флуктуационного теста заключается в следующем: если устойчивые мутанты возникают при контакте с фагом (изменчивость адаптивная), то каждая культура независимо от того, из какой части она была взята, должна содержать приблизительно одинаковое количество устойчивых клеток. Если же устойчивые бактерии возникли спонтанно, до обработки фагом, то следствием этого является тот факт, что их количество в засеянных независимых культурах (100 пробирок) будет отличаться от количества, полученного при анализе образцов, из одной и той же (100 мл) культуры.
В 1949 г. Г. Ньюкомб поставил перераспределительного теста. Принцип, положенный в основу данного теста, предполагает, что устойчивые клетки возникают вследствие спонтанных мутаций до контакта с фагом, и на чашках, где бактерии были перераспределены, должно формироваться больше устойчивых колоний, чем на контрольных чашках, так как каждая клетка из микроколонии устойчивых бактерий после перераспределения сформирует колонию, устойчивую к фагу Т1.
В 1952 г. супруги Е. и Дж. Ледерберг предложили способ непрямого отбора мутантов методом реплик, или отпечатков. Этот метод осуществляется с помощью стерильных кусочков бархата. В итоге была получена суспензия фагоустойчивых мутантов, никогда не имевших контакта с фагом.
Мутационная изменчивость относится к генотипической, или наследственной, изменчивости, так как при этом возникающие изменения в генетическом аппарате бактерий передаются по наследству.
Модификационная изменчивость рассматривается как ответ на изменение условий окружающей среды и наблюдается до тех пор, пока действует фактор, вызывающий эти изменения. Модификационная изменчивость (фенотипическая) проявляется на уровне фенотипа и не затрагивает генотип. Фенотипическая проявляется у подавляющего большинства особей в популяции, в то время как при мутационной изменение генотипа происходит только у единичных клеток.
Наиболее известны адаптивные модификации, ненаследственные изменения, полезные для организма и способствующие его выживанию. Их примером может служить адаптация клеток бактерий E. coli к лактозе как новому субстрату: в этих условиях начинают синтезироваться индуцибельные ферменты, происходит фенотипическое проявление генов, «молчащих» при отсутствии лактозы в среде.
У ряда бактерий обнаружена универсальная адаптивная реакция в ответ на различные стрессовые воздействия (высокие и низкие температуры, резкий сдвиг рН). В данном случае адаптивная реакция проявляется в интенсивном синтезе небольшой группы сходных белков, получивших название белков теплового шока, а явление – синдромом теплового шока. При стрессовых воздействиях на бактериальную клетку в ней ингибируется синтез обычных белков, но индуцируется синтез небольшой группы белков, функции которых заключаются в противодействии стрессовому воздействию путем защиты важнейших клеточных структур, в первую очередь нуклеоида и мембран.
При интенсивном воздействии многих агентов наблюдаются ненаследуемые изменения, случайные по отношению к вызвавшему их воздействию. Причины появления таких фенотипически измененных клеток связаны с ошибками процесса трансляции, вызванными этими агентами.
Возникающие модификации могут быть относительно стабильными и могут сохраняться в течение нескольких поколений или, наоборот, очень лабильными.
- Патогены растений. Бактериозы. Механизмы защиты.
Болезни растений, вызываемые бактериями. В основном они проникают через раневую поверхность, устьица,чечевички, либо с помощью переносчиков.
• увядания – поражение проводящей и корневой систем. Возбудитель локализуется и развивается в проводящих сосудах, вызывая механическую закупорку. Увядание томатов, или «бактериальный рак», вызывают бактерии Clavibacter michiganensis;
• гнили – размягчение и разрушение тканей растений. «Мокрые», или «мягкие», гнили вызывают, например, фитопатогенные бактерии Erwinia carоtovora;
• пятнистости, или некрозы, – отмирание листовой пластинки в местах поражения бактериями. Некрозы плодовых деревьев вызывают бактерии Pseudomonas syringae;
• гипертрофии – усиленное деление клеток и неправильное разрастание тканей, при которых возникают опухоли у растений. К их возбудителям в первую очередь следует отнести Agrobacterium tumefaciens, вирулентные штаммы которых содержат в клетках Ti-плазмиды.
Основными факторами вирулентности фитопатогенных бактерий являются:
1) продукция пектолитических ферментов (пектиназ, протопектиназ, полигалактуроназ), разрушающих пектиновые вещества, из которых состоит межклеточное пространство растительной ткани. Это приводит распаду растительной ткани и образованию «мокрой» гнили;
2) выделение целлюлолитических ферментов (целлюлаз, гемицеллюлаз);
3) образование токсинов, воздействующих на восприимчивые растения, и нарушающих соответствующие ферментативные системы, обмен веществ и вызывающих отмирание либо увядание пораженных тканей или органов. Токсин, синтезируемый бактериями Pseudomonas syringae, является низкомолекулярным пептидом, ингибирущим синтез глутаминсинтетазы, которая необходима для образования хлорофилла (пятнистости). В качестве токсинов могут выступать полисахариды и гликопептиды слизистых слоев бактерий;
4) синтез фитогормонов, стимулирующих разрастание тканей растения с образованием опухолей, например, гетероауксин индолилуксусная кислота, синтезируемая бактериями Agrobacterium tumefaciens. Опухоли могут вызывать сжатие проводящих сосудов с последующей гибелью растения. К фитогормонам относится также гиббереллин, который синтезируется бактериями и вызывает ненормальное удлинение побегов.
Растения имеют определенные механизмы противодействия. Основным является наличие плотного поверхностного барьера у растений. Кутикула обеспечивает практически полную защиту от фитопатогенных бактерий. Защитным механизмом растений является и выделение клеточного сока, имеющего кислую реакцию. Растения также продуцируют вещества, подавляющие или тормозящие рост фитопатогенов. Наиболее активными из них являются фенолы. В тканях растений фенолы встречаются в виде эфиров и гликозидов. Это пирокатехин, гидрохинон, пирогаллол, фенольные спирты, альдегиды и кислоты. Фитонциды – вещества различной химической природы, летучие или растворенные в цитоплазме клеток растения, обладающие широким антибиотическим действием.
Фитоалексины, которые образуются в растении только в процессе заболевания. Примером фитоалексина является ришитин, синтезирующийся в клубнях картофеля, сдерживающий распространение «мокрой» гнили и уменьшающий поражение.
Для борьбы с болезнями растений проводятся следующие мероприятия:
• выведение новых устойчивых сортов;
• чередование сельскохозяйственных культур;
• карантинные мероприятия;
• применение ядохимикатов, микробов-антагонистов или препаратов антибиотиков;
• повышение устойчивости растений путем применения микроэлементов;
• удаление из растения пораженных мест; выкорчевка больных деревьев и т. д.;
• применение здорового посадочного материала;
• борьба с переносчиками бактерий.
- Утилизация веществ микроорганизмами.
Выявление каталазы проводят на предметном стекле в капле 5 % перекиси водорода. При наличии каталазы происходит разложение перекиси водорода с выделением пузырьков кислорода.
Выявление оксидазы также проводят на предметном стекле. Вносят в каплю 1 % р-ра дигидрохлорида тетраметил-n-фенилендиамина. При положит. реакции в течен. мин развивается розово-красная окр-ка.
Выявление дегидрогеназ: в пробирку вносят 1 мл суспензии бактерий, добавляют 0,5 мл 3 % раствора 2,3,5-трифенилтетразолиум хлорида (ТТХ). Смесь помещают в термостат на 30 мин. Если дегидрогеназы восстанавливают ТТХ до формазана, то развив-ся красное окра-ие трифенилформазана.
Утилизация микроорганизмами источников углерода Культуры высевают на среды, содержащие в качестве единственного источника углерода различные моно-, ди- и полисахариды, многоатомные спирты, органические кислоты, углеводороды: глюкозу, фруктозу, арабинозу, ксилозу, рамнозу, маннозу, лактозу, мальтозу, сахарозу, трегалозу, глицерин, маннит. Среды Гисса: • Основной фон (в %, пептон – 0,5; К2НРО4 – 0,1); • Индикатор (бромтимоловый синий, бромкрезоловый пурпурный, феноловый красный);• Исследуемый углевод или спирт (1 %).
Рост микроорганизмов может приводить к накоплению органических кислот, нейтральных продуктов и газов. Образование кислот регистрируется по изменению рН среды, о чем свидетельствует изменение окраски индикатора. Образование газа определяют по появлению пены, разрывов и пузырьков.
Определение способности использовать углеводы на агаризованных синтетич. средах. На пов-сть агаризованной среды с углеводом или спиртом с помощью петли засевают штрихом испытуемые микроорганизмы. Чашки инкубируют приоптимальной для роста температуре. Результаты учитывают по наличию роста культур в сравнении с ростом на контрольной чашке, несодержащей испытуемых соединений.
Определение продукции гидролитических ферментов Микроорганизмы способны использовать в качестве питательных субстратов различные высокомолекулярные соединения: полисахариды, белки, нуклеиновые кислоты, липиды. Макромолекулы не могут проникать через цитоплазматическую мембрану. Первоначально под действием гидролитических ферментов, которые выделяются микроорганизмами, они переходят в низкомолекулярные продукты, которые с помощью специализированных транспортных систем поступают в бактериальные клетки. Микроорганизмы выращивают в питательной среде, которая содержит макромолекулярное соединение. Если клетки образуют экзоферменты, то вокруг колоний, образуется зона продуктов гидролиза.
Определение протеолитической активности заключается в выявлении протеаз, которые катализируют расщепление белков на поли и олигопептиды. Активность последних определяют, используя в качестве субстратов, желатину, казеин и другие белки.
Разжижение желатины. Разжижение желатины регистрируют визуально, при этом отмечают интенсивность и характер разжижения, которое может быть послойным, мешковидным, пузыристым.
О наличии протеолитических ферментов может свидетельствовать и гидролиз казеина. В этом случае обезжиренное (0,3 – 0,5 %) молоко смешивают с питат. средой и определяют образование сгустков. Определение амилолитической активности заключается в посеве на поверхность полноценной питательной среды, которая содержит 0,2 % растворимого крахмала. Через 3 – 5 суток инкубирования на поверхность среды в чашках Петри наносят раствор Люголя. При отрицат. реакции поверхность остается синей. Если бактерии гидролизуют крахмал, то питательная среда не окрашивается.
