Глава III. Самоорганизация живых систем 6 страница

Что такое клон. Греческое слово κλων означаетпобег, отросток. Сейчас клонами называютсяособи животных или растений, полученные путем бесполого размножения и имеющие полностью идентичные генотипы. Клоны очень широко распространены среди растений – все сорта вегетативно размножаемых культурных растений (картофель, плодовые и ягодные растения, гладиолусы, тюльпаны и т.д.) являются клонами. У животных такой тип размножения распространен значительно меньше. Тем не менее, известно более 10000 видов многоклеточных животных, размножающихся путем деления одного организма на два или даже несколько частей, которые вырастают в полноценные организмы. Это и гидры, размножающиеся почкованием, и даже морские звезды и плоские черви. Но позвоночные или насекомые такой способности лишены. Тем не менее, клоны, возникшие естественным путем, встречаются и у млекопитающих.

Монозиготные близнецы. Природными клонами являются так называемые монозиготные близнецы, которые происходят из одной оплодотворенной яйцеклетки. Это случается, когда зародыш на самых ранних стадиях дробления разделяется на отдельные бластомеры, и из каждого бластомера развивается самостоятельный организм. Например, у американского девятипоясного броненосца обычно рождается по четыре монозиготных близнеца. Разделение зародыша на ранней стадии дробления на самостоятельные зародыши – нормальное явление для этого млекопитающего. Такие близнецы представляют собой как бы обособившиеся части одного организма и имеют один и тот же генотип, то есть являются клонами.

Монозиготные (или идентичные) близнецы у человека также являются клонами. Наибольшее известное число родившихся монозиготных близнецов у человека равняется пяти. Причина же, по которой происходит разделение зародыша и образование монозиготных близнецов у человека, неизвестна. Частота этого явления – около 0,3%. Таким образом, клоны животных и человека – нормальное природное явление.

Экспериментальное клонирование животных. Поскольку высшие животные не могут размножаться вегетативно, то для получения клона можно в принципе воспользоваться тремя методами:

1. блокировать первое деление мейоза, получив таким образом диплоидную яйцеклетку, и заставить ее развиваться без оплодотворения;
2. искусственно получить монозиготных близнецов, разделив начавший развиваться эмбрион;
3. удалить ядро из яйцеклетки, заменив его на диплоидное ядро соматической клетки, и тоже заставить развиваться такую «зиготу».

Все эти три возможности ученые использовали для клонирования животных.

Первый способ удается применить не для всех животных. Еще в 30-е годы ХХ века Б.Л.Астаурову удалось с помощью термического воздействия активировать неоплодотворенное яйцо тутового шелкопряда к развитию, блокировав при этом прохождение первого деления мейоза. Ядро яйцеклетки при этом оставалось диплоидным. Развитие такой диплоидной яйцеклетки заканчивалось вылуплением личинок, точно повторяющих генотип матери. К сожалению, успех с тутовым шелкопрядом является исключением – у других животных получить клоны, как правило, таким способом не удается. Исследователи пробовали удалять пронуклеусы (еще не успевшие слиться ядра яйцеклетки и проникшего в нее при оплодотворении сперматозоида) из оплодотворенной яйцеклетки мыши, заменяя их полученными из других яйцеклеток. Если вводили и мужской и женский, пронуклеусы, эмбрион развивался нормально. Введение двух женских или двух мужских пронуклеусов, несмотря на сохранение диплоидности, не приводило к успеху, несмотря на то, что такая зигота имеет полный комплект генетического материала. Такие зиготы начинали дробиться, однако развитие прекращалось на ранней стадии, и получить таким способом клоны млекопитающих оказалось невозможно. Эти эксперименты показали, что для нормального развития эмбрионов млекопитающих необходимы два разных генома – материнский и отцовский, в которых импринтированы разные гены (см. § 26).

Второй метод – разделение эмбриона на ранних стадиях дробления в эмбриологии используют очень давно, правда в основном на морских ежах и лягушках. Клоны-монозиготные близнецы млекопитающих были получены существенно позже, но искусственное разделение эмбрионов и последующая их имплантация «суррогатным матерям» уже применяется в селекции сельскохозяйственных животных для получения большого числа потомков от особо ценных родителей. В 1999 году таким способом была клонирована обезьяна. Оплодотворение было проведено в пробирке. Зародыш на стадии восьми клеток был разделен на четыре части, и каждая двуклеточная часть была имплантирована в матку другой обезьяны (рис. 61, Б). Три зародыша при этом развиваться не стали, а из четвертого родилась обезьянка, которую назвали Тетра (Четвертинка).

Метод пересадки ядер был разработан еще в 40-х годах ХХ века русским эмбриологом Г. В. Лопашовым, работавшим с яйцеклетками лягушки. Правда, взрослых лягушек он не получил. Позднее англичанину Дж. Гёрдону удалось заставить яйцеклетки лягушки с чужим ядром развиваться до получения взрослых особей (рис. 61, А). Он использовал клетки плавательной перепонки и клетки эпителия кишечника. До взрослого состояния развивалось не более 2% таких яйцеклеток, причем выросшие из них лягушки отличались меньшими размерами и пониженной жизнеспособностью по сравнению с их нормальными сверстниками.

Клонирование млекопитающих. Пересадить ядро в яйцеклетку млекопитающего значительно труднее, так как она примерно в 1000 раз мельче, чем яйцеклетка лягушки. Поэтому экспериментаторы пошли другим путем – стали просто проводить слияние яйцеклетки, лишенной собственного ядра, с целой неповрежденной соматической клеткой.

Группа исследователей из Рослинского института в Шотландии, возглавляемая Я. Вилмутом, клонировавшие в 1996 году овечку Долли (рис. 61, В), использовали для слияния клеток электрический импульс. Они удаляли ядра из зрелых яйцеклеток, затем с помощью микропипетки вводили под оболочку яйцеклетки соматическую клетку, выделенную из молочной железы овцы. С помощью электрического удара клетки сливались и активировались к делению. Затем, после культивирования в течение 6 дней в искусственных условиях, начавший развиваться эмбрион на стадии морулы имплантировали в матку специально подготовленной овцы другой породы (хорошо отличавшейся фенотипически от донора генетического материала). Рождение овечки Долли стало громкой сенсацией, а у некоторых ученых возникли сомнения в том, что она действительно была клоном. Однако специальные проведенные исследования ДНК показали, что Долли – настоящий клон.

 Группе ученых из университета Гонолулу под руководством Риузо Янагимачи удалось с помощью изобретенной ими микропипетки осуществить перенесение ядра соматической клетки непосредственно в яйцеклетку. Это позволило им обойтись без электрического импульса, который был далеко небезопасен для живых клеток. Кроме того, они использовали менее дифференцированные клетки – это были фолликулярные клетки (соматические клетки, окружающие яйцеклетку и сопровождающие ее во время движения по яйцеводу). К настоящему времени этим методом клонированы и другие млекопитающие – корова, свинья, мышь, кошка, собака, лошадь, мул, обезьяна.

Зачем клонировать животных? Клонирование млекопитающих чрезвычайно важно для фундаментальной науки. Это уникальный инструмент, позволяющий исследовать один из самых сложных и интригующих вопросов биологии – какими путями информация, записанная последовательностью нуклеотидов в ДНК реализуется во взрослом организме, каким образом осуществляется точнейшее взаимодействие тысяч генов, каждый из которых «включается» и «выключается» именно в то время и в той клетке, где это необходимо. Известно, что некоторые гены, работающие на самых ранних этапах эмбриогенеза, в ходе дальнейшего развития и дифференцировки клеток необратимо выключаются. Можно ли заставить дифференцированную клетку претерпеть обратную дифференцировку? На последний вопрос без клонирования ответить вообще невозможно. Часто животные клонированы из недифференцированных – эмбриональных стволовых клеток или из фолликулярных клеток. В других случаях, возможно, также были использованы стволовые клетки. В частности, овечка Долли была клонирована из клетки молочной железы беременной овцы, а при беременности под действием гормонов стволовые клетки молочной железы начинают размножаться, так что вероятность того, что экспериментаторы возьмут именно стволовую клетку, повышается. Предполагают, что именно так и было с Долли. Этим может объясняться и очень малая эффективность клонирования – ведь стволовых клеток в ткани немного.

Какая же практическая польза может быть от клонированных животных? В первую очередь, клонирование высокопродуктивных домашних животных может быть использовано для получения в короткий срок больших количеств элитных коров, ценных пушных зверей, спортивных лошадей и т.д. Особые надежды ученые возлагают на клонирование диких животных, которым грозит исчезновение. Уже в настоящее время создаются «Замороженные Зоопарки» – образцы клеток таких животных, хранящиеся в замороженном виде при температуре жидкого азота (-196°С). В Америке уже родились два детеныша дикого быка бантенга, клонированные из клеток животного, умершего в 1980 году. Его клетки были заморожены и более 20 лет хранились в жидком азоте. Клонированы также другой вид дикого быка гаур, европейский дикий баран, дикие африканские степные кошки.

Здесь следует сказать и о надеждах клонировать уже исчезнувших животных – мамонта, тасманийского сумчатого волка, зебры квагги. Оптимисты предполагают, что можно использовать ДНК этих животных, сохранившуюся либо в вечной мерзлоте, либо в законсервированных тканях. Однако предпринятая попытка клонировать тасманийского сумчатого волка, последний экземпляр которого погиб в зоопарке в 1936 году, не удалась. Это и не удивительно, так как в распоряжении ученых не было живых клеток, а только образцы тканей, хранившиеся в спирте. Из них была выделена ДНК, но она оказалась слишком поврежденной, да и существующие в настоящее время методы не позволяют клонировать животных, не имея достаточного количества живых клеток. По этой же причине мала вероятность когда-либо клонировать мамонта. Во всяком случае, все предпринятые попытки культивировать клетки мамонта, пролежавшие тысячелетия в вечной мерзлоте, оказались безуспешными. Кроме того, следует иметь в виду, что если даже и удалось бы получить и вырастить один клон мамонта или квагги, это не было бы воскрешением вида. Из одного или даже из нескольких экземпляров получить вид нельзя. Считается, что для устойчивого существования и воспроизведения вида необходимо, по крайней мере, несколько сотен особей.

Безусловно, клонирование является незаменимым методом для получения трансгенных млекопитающих. Хотя применяются и другие методы получения трансгенных животных, именно клонирование позволяет получать животных с заданными свойствами для практических нужд. В том же Рослинском институте в Эдинбурге, где родилась Долли, в 1997 году были получены и клонированные овечки Полли и Молли. Для их клонирования были использованы генетически измененные клетки, культивировавшиеся в искусственных условиях. Эти клетки, кроме обычных овечьих генов, несли человеческий ген IX фактора свертываемости крови. Генетическая конструкция содержала промотор, экспрессирующийся в клетках молочной железы. Поэтому белок, кодируемый этим геном, выделялся с молоком. Полли была первым клонированным трансгенным млекопитающим.

Трудности и проблемы, возникающие при клонировании млекопитающих. Несмотря на впечатляющие успехи, пока нельзя утверждать, что клонирование стало обычной лабораторной методикой. Это по-прежнему очень сложная процедура, не слишком часто приводящая к ожидаемому результату. Какие же трудности возникают при клонировании животных?

В первую очередь, это низкая эффективность клонирования. Процедуры, применяемые при клонировании млекопитающих, являются весьма травмирующими для клеток. Далеко не всем клеткам удается их благополучно пережить. Не все начавшие развиваться эмбрионы доживают до рождения. Так, чтобы получить Долли, пришлось для выделения яйцеклеток прооперировать 40 овец. Из 430 яйцеклеток удалось получить 277 диплоидных «зигот», из которых только 29 начали развиваться и были имплантированы «суррогатным» матерям. Из них дожил до рождения всего один эмбрион – Долли. Однако, совершенствование экспериментальной техники постепенно увеличивает эффективность клонирования. Так, в 2006 году появились на свет четыре «новые Долли» – клоны, полученные из клеток того же самого образца ткани (он 10 лет хранился в морозильнике), что и Долли. На этот раз для получения одной овечки было использовано в среднем 5 «зигот». В целом же эффективность клонирования выше, если для него берутся эмбриональные клетки. Возможно, это связано с тем, что клонирование удается в основном из стволовых клеток, которых во взрослом организме немного.

Другой серьезной проблемой является здоровье родившихся клонов. Многие клонированные животные, вполне здоровые при рождении, доживали до взрослого состояния и рождали нормальных детенышей. Однако потом у них проявлялись нарушения со стороны разных систем органов. Так Долли родилась здоровой и родила нескольких здоровых ягнят, но потом начала стремительно стареть и прожила вдвое меньше, чем обычная овца. Трансгенные Полли и Молли, также клонированные в Рослинском институте, прожили еще меньше. По некоторым данным очень многие клоны обладают слабым иммунитетом, подвержены простудным и желудочно-кишечным заболеваниям и стареют в 2-3 раза быстрее своих генетических родителей. Исследования японских ученых показали, что у клонированных мышей серьезно нарушено функционирование примерно 4% генов.

Но, пожалуй, самым обескураживающим оказалось то, что клоны могут довольно сильно отличаться от оригинала. Несколько лет назад в США родилась очередная клонированная кошечка, которую назвали Сиси (Сс, CopyCat). Генетической мамой ее была трехцветная кошка Рэйнбоу (Радуга). Сиси оказалось непохожей на маму – двухцветной. Но анализ ДНК показал, что она действительно является клоном Радуги. Различия связаны с тем, что ген рыжей окраски находится в Х-хромосоме. У самок одна из Х-хромосом оказывается инактивированной в раннем эмбриогенезе. Инактивируются Х-хромосомы случайно, состояние инактивированности в клетке и клетках-потомках сохраняется на всю жизнь. У гетерозиготной кошки «рыжими» оказываются те клетки, где инактивирована «нерыжая» Х-хромосома. Клон был получен из одной соматической клетки, в которой одна из Х-хромосом уже была инктивирована. У Сиси инактивированой оказалось «рыжая» Х-хромосома. У млекопитающих в Х-хромосоме находится около 5% всех генов, и клоны могут оказаться непохожими друг на друга по достаточно большому числу признаков.

Могут быть и другие причины непохожести клонов. Все искусственно полученные клонированные эмбрионы развиваются не в таких условиях, как оригинал. Другими являются: возраст суррогатной матери, её гормональный статус, питание и т. п. А эти факторы очень важны во время эмбриогенеза. Причинами различий клона и оригинала могут быть и вариации фенотипического проявления генов (экспрессивность и пенетрантность), различия в геноме митохондрий (клоны имеют не такие митохондрии, как оригинал), отличия в рисунке инактивации (импринтинг) некоторых генов в эмбриогенезе, неустранимые различия ядер соматических и половых клеток (например, неполная дедифференцировка ядра соматической клетки, помещенного в яйцеклетку).

 

§ 36. Стволовые кдетки.

Стволовыми клетками называют клетки многоклеточного организма, сохранившие способность к дифференцировке в разных направлениях. Из стволовой клетки может развиться любая клетка организма – нервная, костная, мышечная и т. д. Ранее считалось, что такие клетки существуют только во время эмбрионального развития, а во взрослом организме их нет. Но в 70-х годах ХХ века российскими учеными такие клетки были обнаружены в строме (греч. – подстилка, опорная структура органа или ткани) костного мозга.После этого стволовые клетки были обнаружены практически во всех органах взрослых животных. Эти клетки служат для возобновления погибших клеток. Различают эмбриональные стволовые клетки и так называемые региональные (находящиеся в составе органа или ткани) стволовые клетки.

Стволовые клетки могут быть тотипотентными (лат. totus – общий, целый, potentia – способность), то есть способными дифференцироваться в любой из возможных типов клеток. Как правило, тотипотентностью обладают клетки на самых ранних стадиях эмбриогенеза. Различают также плюрипотентность – способность клетки дифференцироваться во множество тканей взрослого организма, и мультипотентност ь — способность клетки дифференцироваться в несколько видов тканей взрослого организма.

Эмбриональные стволовые клетки. У млекопитающих эмбриональные клетки являются тотипотентными на стадии нескольких бластомеров, когда каждый бластомер способен дать начало полноценному организму. В ходе дальнейшего развития эмбриона образуется бластоциста – пузырек, состоящий из примерно сотни клеток, в котором различают наружный слой клеток и внутреннюю клеточную массу. Именно она и представляет собой собственно эмбрион (рис. 62, А). Эти клетки являются плюрипотентными – они могут дифференцироваться во все ткани взрослого организма, но не могут создавать поддерживающие и питающие ткани плода. Эмбриональные стволовые клетки можно выделить из эмбрионаи поддерживать их рост в искусственных условиях (рис 62, Б). При этом клетки начинают формировать структуры, напоминающие эмбрион – эмбриоидные тельца (рис. 62, В), внутри которых образуется полость и начинается дифференцировка клеток (рис. 62, Г). Конечно, нормального эмбриона не получается – развитие останавливается. По-видимому, слишком сложно соблюсти нужные для этого условия, существующие в организме матери. Тем не менее, к настоящему времени ученым удалось добиться дифференцировки эмбриональных стволовых клеток in vitro (дословно «в пробирке», то есть вне организма) в самые разные клетки, характерные для взрослого организма – нервные клетки, клетки кожи, сердечной мышцы, кроветворные клетки, клетки эндотелия кровеносных сосудов, клетки, продуцирующие инсулин.

Такие свойства стволовых клеток открывают почти безграничные перспективы для лечения самых разных заболеваний – и связанных с гибелью нервных клеток (например, болезни Альцгеймера, Паркинсона), и последствий тяжелых травм, восстановления утраченных органов, и многих наследственных заболеваний. В США планируются клинические испытания лечения травм спинного мозга с помощью клеток, дифференцировавшихся in vitro из эмбриональных стволовых клеток.

Но применение эмбриональных стволовых клеток человека для лечения наталкивается на некоторые очень серьезные трудности. Одна из них состоит в том, что эмбриональные клетки при введении взрослым животным очень часто образуют злокачественные опухоли. По-видимому, не все еще понятно в сложнейшем процессе дифференцировки и взаимодействия клеток в организме. Вторая и, возможно, главная проблема – этическая. Вопрос в том, допустимо ли разрушение человеческого эмбриона для лечения другого человека? Поскольку человечество никогда ранее не сталкивалось с подобными проблемами, то оно и не выработало четкого ответа на вопрос – когда эмбрион становится человеком? Разрушая бластоцисту, мы разрушаем комочек клеток или человека? Очень многие общественные и церковные деятели считают это убийством, многие ученые – тоже. По-видимому, все же разрушение эмбрионов для получения стволовых клеток применяться не будет. К счастью, есть другие источники стволовых клеток.

Фетальные стволовые клетки. Важным источником стволовых клеток для человека могут быть клетки пуповинной крови. Когда ребенок рождается, ему перерезают пуповину, в которой остается довольно много крови. Как оказалось, в этой крови немало стволовых клеток. Это не эмбриональные клетки, но они являются плюрипотентными. Уже предпринимаются успешные попытки использования этих клеток в клинической практике. Пуповинную кровь можно собрать, из нее выделить стволовые клетки, которые при температуре жидкого азота могут храниться десятилетиями без потери жизнеспособности. Уже сейчас в некоторых странах, включая Россию, созданы криобанки для хранения стволовых клеток из пуповины. В случае необходимости они смогут быть использованы для лечения их «хозяев».

Региональные стволовые клетки. Еще недавно ученые думали, что стволовых клеток во взрослом организме очень мало. Но теперь ясно, что стволовые клетки имеются практически в каждом органе. Региональные стволовые клетки отличаются от эмбриональных – они являются мультипотентными, то есть способными к дифференцировке во многие ткани организма, но не во все, как эмбриональные клетки. Региональные стволовые клетки участвуют в регенерации поврежденных органов, правда, у млекопитающих, и у человека в частности, способность к регенерации весьма ограничена. Но и у них есть такая ткань, которая обновляется постоянно – это кровь.

Стволовые клетки крови находятся в костном мозге (рис. 62, Д). Они способны дифференцироваться в любую клетку крови. Но кроме них в костном мозге есть и так называемые стромальные клетки. Названы они были так потому, что считалось, что их функция – создавать строму, сеть, в ячейках которой «живут» стволовые клетки крови. Но сейчас показано, что именно стромальные клетки являются плюрипотентными, способными превращаться практически в любую клетку организма. Показано, что они, способны поступать с кровотоком в поврежденный орган или ткань и давать начало нужным специализированным клеткам, которые замещают погибшие. Но для регенерации обширных участков тканей этого, по-видимому, недостаточно. Для того, чтобы их использовать в практике, их будут брать у пациента, размножать в искусственных условиях, путем обработки специальными сигнальными веществами заставлять дифференцироваться в нужном направлении и только потом возвращать их в организм. Уже есть примеры успешного применения стромальных клеток при лечении последствий инфаркта, для сращивания переломов костей. Уже проведены успешные эксперименты по дифференцировке стромальных клеток в клетки, продуцирующие инсулин. При этом такие клетки даже в искусственной среде формируют структуры, похожие на островки Лангерганса, которые производят инсулин в организме.

По-видимому, именно стромальные клетки будут применяться в медицине будущего. У них есть, по крайней мере, два очень важных преимущества перед эмбриональными клетками. Во-первых, не возникает никаких этических проблем. Во-вторых, человеку вводят его собственные клетки. А это означает, что нет никаких проблем с иммунологической несовместимостью. Ведь именно это является основным осложняющим фактором при трансплантации органов. Можно сказать, что стромальные клетки костного мозга – самой природой созданный «склад запчастей» для человека, нужно только научиться его использовать. Скорее всего, это дело ближайшего будущего.