1. Продолжение работы по идентификации культуры, выделенной из органов зараженного животного в результате биопробы:
· отбор колонии на пластинчатом МПА для последующего исследования;
· характеристика свойств колонии по следующим критериям: величина, цвет, форма, характер края и поверхности, структура;
· изготовление микропрепарата, окраска его по Граму, микроскопия;
· учет биохимической активности выделенного возбудителя,
· постановка ориентировочной реакции агглютинации на стекле с агглютинирующимисыворотками S.enteritidis, S.choleraesuis, S. typhimurium: по 1 капле соответствующих сывороток в разведении 1:10 наносят пастеровской пипеткой на предметное стекло; капля физиологического раствора используется для контроля. В каждую каплю вносят петлей небольшое количество культуры и эмульгируют ее. Через несколько минут в одной из капель образуются хлопья – агглютинация. Контрольная капля и капли с сыворотками, где результат отрицательный, остаются мутными. На основании результатов опыта сделать заключение о виде выделенного возбудителя.
2. Постановка и учет развернутой реакции агглютинации с сывороткой крови больного при подозрении на бруцеллез (14 день заболевания).
Сыворотка больного титруется, т.е. последовательно разводится в физиологическом растворе. Разведение в пробирке № 1 - 1:50, в пробирках №№ 2, 3, 4, 5 разведения соответственно 1:100, 1:200, 1:400, 1:800. Их получают, смешивая равные объемы (по 0,5 мл) физиологического раствора и разведенной сыворотки из предыдущей пробирки. Во все пробирки вносят равные количества бруцеллезного диагностикума (взвесь убитых бактерий) - по 2 капли. Пробирки инкубируют в термостате при 370 С в течение 2 часов, 18-20 часов при комнатной температуре. В контрольных пробирках находятся только физиологический раствор и диагностикум или сыворотка - в них результат будет отрицательным: частицы диагностикума опустятся на дно пробирки в виде маленького белого диска. В положительном случае на дне пробирки выпадает осадок хлопьев в виде «зонтика». Титр антител определяют по наибольшему разведению сыворотки, при котором наблюдается образование агглютината. Диагностический титр антител при бруцеллезе - 1:100. Реакцию ставят по следующей схеме (табл. 9):
Таблица 9. Постановка развернутой реакции агглютинации
| Компоненты реакции | Разведения сыворотки | КД | КПС | |||
| 1:25 | 1:50 | 1:100 | 1:200 | |||
| Физиологический раствор в мл | - | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | - |
| Исследуемая сыворотка в мл | 1,0 | 
1,0
| 
1,0
| 
1,0
| - | 1,0 |
| Диагностикум, капли |
КД – контроль диагностикума, КПС – контроль положительной сыворотки
В развернутой реакции агглютинации студентам необходимо определить титр (количество) антител в сыворотке по наибольшему разведению, где наблюдается положительный результат.
3. Определение фагоцитарной активности нейтрофилов (завершенный фагоцитоз стафилококка). Фагоцитоз - это поглощение лейкоцитами и макрофагами микробов, чужеродных частиц, "обломков" погибших клеток, иммунных комплексов (конгломерат антитело + антиген). Фагоцитоз может заканчиваться перевариванием микробов - завершенный фагоцитоз. В пробирку помещают 0,1 мл 2% раствора лимоннокислого натрия, 0,2 мл исследуемой крови, 0,1 мл взвеси тест - культуры стафилококка (концентрация 400 млн. микробных тел в 1 мл), содержимое пробирки тщательно перемешивают и помещают в термостат при 37°С на 30 мин. Затем пробирки центрифугируют и из сероватой пленки на границе плазмы и эритроцитов готовят мазки, которые фиксируют в смеси Никифорова и окрашивают по Романовскому-Гимза. Микроскопируют с использованием иммерсионной системы. Определяют фагоцитарную активность лейкоцитов (ФА - процент фагоцитирующих клеток при подсчете 100 фагоцитов) и фагоцитарный показатель (ФП - число микробов, поглощенных одним лейкоцитом). У здоровых лиц ФП составляет 5-9, ФА - 50 – 70%.
4. Изучение незавершенного фагоцитоз гонококка (микроскопия демонстрационного микропрепарата, приготовленного из гнойного отделяемого уретры больного гонореей – рис. 37, см. приложение). Незавершенный фагоцитоз – это состояние, когда лейкоциты не в состоянии уничтожить и переварить захваченные микроорганизмы.
5. Учет реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с сывороткой крови больного при подозрении на носительство брюшнотифозного микроба - демонстрация. РНГА используется для выявления антител в крови больного или для идентификации неизвестного возбудителя по антигенам в патологическом материале. Соответственно используют коммерческие эритроцитарные диагностикумы из эритроцитов, нагруженных антигенами или антителами. В данном случае используется антигенный Vi – эритроцитарный брюшнотифозный диагностикум. Постановка реакции: в лунках пластмассовых пластин готовят разведения сыворотки больного от 1:25 до 1:200 в объеме 0,5 мл, в каждую лунку вносят по 2 капли эритроцитарного диагностикума, инкубируют при 370С в течение 2 часов. Положительная реакция характеризуется образованием на дне лунки осадка с неровным краем в виде «зонтика» или «розетки», при отрицательном результате выпадает осадок в виде «пуговки» Диагностический титр 1:100. Контроли – КПС (контроль положительной сыворотки - эритроцитарный диагностикум + сыворотка, содержащая антитела к Vi-антигену возбудителя брюшного тифа + физиологический раствор); КД – (контроль диагностикума - эритроцитарный диагностикум + физиологический раствор, гемагглютинации не наблюдается).
Рис. 13. Завершенный фагоцитоз стафилококка
Ход реакции: в лунках пластмассовых пластин готовят разведения сыворотки больного от 1:25 до 1:200 в объеме 0,5 мл, в каждую лунку вносят по 2 капли эритроцитарного диагностикума, инкубируют при 370С в течение 2 часов. Положительная реакция характеризуется образованием на дне лунки осадка с неровным краем в виде «зонтика» или «розетки», при отрицательном результате выпадает осадок в виде «пуговки» Диагностический титр 1:100. Контроли – КПС (контроль положительной сыворотки - эритроцитарный диагностикум + сыворотка, содержащая антитела к Vi-антигену возбудителя брюшного тифа + физиологический раствор); КД – (контроль диагностикума - эритроцитарный диагностикум + физиологический раствор, гемагглютинации не наблюдается).
Рис. 14. Незавершенный фагоцитоз гонококка
