Ферменты при нагревании до 60-80 оС утрачивают свои свойства биологических катализаторов. Степень инактивирования зависит и от длительности теплового воздействия. При низких температурах ферменты хорошо сохраняются, но скорость ферментативного катализа резко снижается. В термолабильности ферментов можно убедиться на примере действия фермента слюны – амилазы и мальтазы.
ПРИНЦИП РАБОТЫ:
Амилаза катализирует гидролиз крахмала и гликогена до дисахарида мальтозы. Мальтаза расщепляет мальтозу до глюкозы. Крахмал дает с йодом синее окрашивание, амилодекстрины (наиболее сложные) – фиолетовое, эритродекстрины – краснобурое, ахродекстрины – желтое (цвет йода в воде). Мальтоза и глюкоза имеют свободные альдегидные группы и дают реакцию Троммера, которая основана на способности углеводов при нагревании восстанавливать гидрат окиси меди (голубого цвета) в гидрат закиси желтого цвета. При дальнейшем нагревании гидрат закиси переходит в красную закись меди.
РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:
1) слюна в разведении 1:5; 2) крахмал, 1 % раствор; 3) NaOH, 10 %; 4) CuSO4, 1 %; 5) 0,1 % раствора йода в 0,2 % йодистом калии; 6) мерные цилиндры на 10 или 25 мл; 7) пипетки на 1 и 5 мл; 8) термостат или водяная баня (температура 38о); 9) пипетки глазные; 10) стакан со льдом или холодильник; 11) предметные стекла; 12) карандаши по стеклу.
ХОД РАБОТЫ:
Готовят разведение слюны 1:5. В чистую пробирку отливают небольшое количество слюны разведенной 1:5 (2 или 3 мл) и кипятят ее в течение 5-8 минут, после чего охлаждают.
В четыре чистые пронумерованные пробирки приливают по 10 капель 1 % раствора крахмала.
В пробирку №1 и в пробирку №2 добавляют по 10 капель слюны, разведенной 1:5. В пробирку №3 добавляют 10 капель прокипяченной слюны. В пробирку №4 (контрольная) добавляют 10 капель дистиллированной воды.
Пробирку №1 помещают на 10 минут в термостат или водяную баню при 38оС.
Пробирку №2 помещают на 10 минут в стакан со льдом.
Пробирки №3 и №4 оставляют на 10 минут при комнатной температуре.
Затем с содержимым каждой пробирки проделывают качественные реакции на крахмал (реакция с йодом) и продукты его расщепления (реакция Троммера), для чего содержимое каждой пробирки делят на две части.
Реакция на крахмал: к 5 каплям исследуемого раствора приливают 1 каплю раствора йода в йодистом калии. В присутствии крахмала появляется синее окрашивание.
Реакция Троммера: к 5 каплям исследуемой жидкости прибавляют 5 капель 10 % раствора NaOH и 5 капель 1 % раствора CuSO4, нагревают. В присутствии глюкозы и мальтозы выпадает желтый осадок гидрата закиси меди или красный осадок закиси меди.
Результаты занести в таблицу 7. Сделать вывод об оптимальной температуре для действия исследуемого фермента.
Таблица 7
| № | Субстрат | Фермент | Температура | Реакция на крахмал с йодом | Реакция Троммера | ВЫВОД |
| 1. | ||||||
| 2. | ||||||
| 3. | ||||||
| 4. |
Лабораторная работа №14
ВЛИЯНИЕ РЕАКЦИИ СРЕДЫ НА ДЕЙСТВИЕ ФЕРМЕНТОВ СЛЮНЫ
ПРИНЦИП РАБОТЫ:
Каждый фермент наиболее активен в пределах довольно узкой зоны рН (оптимум рН). При изменении рН в любую сторону от оптимального значения активность фермента уменьшается. Отклонение рН от оптимума может нарушать связь между белковой частью ферментов и их простетическими группами, может влиять на связывание субстрата с ферментов. Оптимум рН для амилазы слюны равен 6,9.
РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:
1) слюна в разведении 1:100 (1:50); 2) крахмал, 0,5 % раствор; 3) Na2HPO4, 0,2 М раствор; 4) лимонная кислота, 0,1 М раствор; 5) раствор 0,1 % йода в 0,2 % йодистом калии; 6) NaCl, 1 % раствор; 7) микробюретки; 8) водяная баня или термостат (температура 38о); 9) пипетки на 1 мл.
ХОД РАБОТЫ:
В 7 пронумерованных пробирок наливают 0,2 М раствор Na2HPO4 и 0,1 М раствор лимонной кислоты в соотношениях, указанных в таблице 9. Получают буферные растворы с рН от 5,6 до 8,0. В каждую пробирку добавляют по 10 капель 1 % раствора NaCl и 0,5 % раствора крахмала, по 10 капель слюны, разведенной в 50 или 100 раз (согласно таблице 8).
Таблица 8
