Формоловое титрование (по серенсену)

 

ПРИНЦИП РАБОТЫ:

При гидролизе белка вследствие разрыва пептидных связей в нем происходит нарастание одновременно карбоксильных и аминных групп в эквивалентных количествах. Для определения количества карбоксильных групп используется метод Серенсена.

Аминокислоты в водных растворах образуют внутримолекулярные соли, поэтому без предварительного блокирования аминогрупп формальдегидом непосредственно титровать карбоксильные группы аминокислот щелочью невозможно. В процессе реакции с формальдегидом аминогруппа теряет свои основные свойства.

Образующееся метиленовое соединение (метиленаминокислота) легко может быть оттитровано щелочью.

Определяя количество карбоксильных групп титрованием, одновременно можно судить и о содержании аминных групп, так как количество титруемых карбоксильных групп эквивалентно количеству связанных формальдегидом аминных групп. Метод формолового титрования позволяет следить за ходом гидролиза белка и изучать действие протеолитических ферментов.

Конец гидролиза белка совпадает с моментом, когда количество аминных и карбоксильных групп в гидролизате перестанет увеличиваться и наблюдается отрицательная биуретовая реакция.

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) животный уголь, тщательно измельченный; 2) CH₃COOH, 1 %; 3) формалин нейтральный, 20 %; 4) фенолфталеин; 5) NaOH, 0,005 н.; 6) HCl или CH₃COOH, 1 %; 7) конические колбы на 50 мл; 8) пипетки на 1 и 2 мл; 9) микробюретки; 10) цилиндр мерный на 25 мл.

ХОД РАБОТЫ:

1. Титрование карбоксильных групп в растворе белка до гидролиза. Отмеривают в колбочку 1 мл раствора яичного белка, приливают 5 капель 20 % нейтрального раствора формалина и 3 капли 0,5 % раствора фенолфталеина. Титруют из микробюретки 0,005 н. раствором NaOH до устойчивой бледно-розовой окраски.

2. Титрование карбоксильных групп после гидролиза белка (т.е. в гидролизате). Через 45 или 90 минут гидролиз прерывают, а в колбочку всыпают (на кончике ножа) животный уголь для обесцвечивания буроватого раствора, взбалтывают и кипятят 5 минут. Затем гидролизат охлаждают, выливают в цилиндр, доводят объем жидкости до 25 мл дистиллированной водой и фильтруют.

Отмеривают в колбочку 1,25 мл гидролизата, добавляют 3 капли раствора фенолфталеина и нейтрализуют 10 % раствором NaOH из макробюретки до слабо-розовой окраски. Если при нейтрализации окраска делается ярко-красной, то добавляют до обесцвечивания по каплям 1 % раствор уксусной кислоты, избыток которой нейтрализуют 1 % раствором NaOH до слабо-розовой окраски. Затем приливают 5 капель нейтрального 20 % раствора формалина и обесцвеченный раствор титруют 0,005 н. раствором NaOH до бледно-розового цвета и точно отмечают количество затраченной щелочи.

3. Расчет азота аминогрупп производят по количеству затраченной щелочи, исходя из ее нормальности.

Заполнить таблицу 5.

Таблица 5

Ход работы	Количество мл щелочи (до гидролиза белка)	Количество мл щелочи (после 45 минут гидролиза белка)	Количество мл щелочи (после 90 минут гидролиза белка)	Расчет азота аминогрупп по количеству затраченной щелочи

 

ВЫВОД:

 

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ:

 

Что такое гидролиз белка и как его производят?

Как установить конец гидролиза белка?

Какое значение имеет определение карбоксильных групп методом формолового титрования?

Каков принцип и химизм формолового титрования?

Как различаются белки по форме их молекул?

Что понимают под первичной структурой белка? Какие связи формируют эту структуру?

Что представляет собой вторичная структура белка? Какие связи ее формируют?

Что такое водородная связь?

Что понимают под третичной структурой белка? Какие связи формируют эту структуру?

Чем различаются структуры молекул глобулярных и фибриллярных белков?

Что понимают под четвертичной структурой белка?

Какими методами изучают структуру белковой молекулы?

 

Тема 5