Ферменты пищеварительного тракта, ускоряющие переваривание белков, жиров и углеводов пищи, относятся к классу гидролаз. Ферменты, принимающие участие в расщеплении белков в желудочно-кишечном тракте, относятся к подклассу пептид-гидролаз. Особенностью пепсина является то, что он максимально активен в резко кислой среде (оптимум рН 1,0-2,0).
ПРИНЦИП РАБОТЫ:
Створаживание молочно-ацетатной смеси при рН 4,9 и температуре 25 ºС пепсином происходит в соответствии с его способностью переваривать белки. За единицу активности пепсина принимают такое его количество, которое при указанных условиях створаживает 5 мл молочно-ацетатной смеси за 1 мин (эта условная единица соответствует 0,01 мг кристаллического пепсина). В норме желудочный сок человека содержит в 1 мл 40-60 ед. пепсина.
РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:
1) ацетатный буфер с рН 4,9; 2) молочно-ацетатная смесь; 3) раствор пепсина или желудочный сок; 4) пробирки, пипетки, секундомер.
ХОД РАБОТЫ:
В пробирку №1 помещают 1 мл желудочного сока (или раствора пепсина).
В пробирку №2 – 3 мл молочно-ацетатной смеси и прогревают 5 минут при 25 ºС. Затем быстро переливают молочно-ацетатную смесь в первую пробирку и включают секундомер. Как только на стенках пробирки появятся первые хлопья казеина, останавливают секундомер. Для расчета активности пепсина в 1 мл число 60 делят на количество секунд – получают количество единиц пепсина в 1 мл желудочного сока.
Например, 40 ед. соответствует 0,4 мг кристаллического пепсина.
Результат занести в таблицу 12.
Таблица 12
| № | Фермент | Субстрат | Реакция, катализируемая ферментом | Время действия | Количество пепсина в 1мл |
Лабораторная работа №17
ДЕЙСТВИЕ ПЕПСИНА НА БЕЛОК ФИБРИН
ПРИНЦИП РАБОТЫ:
Протеолитическую активность пепсина наблюдают, добавив к его подкисленному раствору небольшое количество фибрина. Фибрин, нерастворимый в воде, под действием пепсина гидролизуется до растворимых в воде пептидов.
РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:
1) 1 % раствор препарата пепсина в 0,2 % растворе HCl; 2) фибрин; 3) водяная баня; 4) пробирки; 5) пипетки; 5) термометр.
ХОД РАБОТЫ:
В пробирку №1 приливают 15 капель или 0,5 мл раствора пепсина, в пробирку №2 – такое же количество предварительно прокипяченного раствора пепсина. В каждую пробирку опускают небольшой кусочек фибрина. Обе пробирки помещают в водяную баню при температуре 38 оС на 60 минут. Наблюдают растворение фибрина.
Результаты занести в таблицу 13.
Таблица 13
| № | Фермент | Субстрат | Изменение субстрата | ВЫВОД |
Лабораторная работа №18
ОБНАРУЖЕНИЕ КАТАЛАЗЫ В КРОВИ
По химической природе каталаза является геминферментом. Каталаза катализирует разложение перекиси водорода на молекулярный кислород и воду: 2Н2О2 → О2↑ + 2Н2О
Биологическая роль каталазы заключается в обезвреживании перекиси водорода, образующейся в организме во время течения окислительно-восстановительных процессов.
ПРИНЦИП РАБОТЫ:
Об активности каталазы крови судят по бурному выделению пузырьков кислорода при добавлении перекиси водорода к капле крови.
РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:
1) кровь; 2) Н2О2, 1 % раствор; 3) штатив с пробирками; 4) капельницы.
ХОД РАБОТЫ:
В пробирку наливают 10-15 капель 1 % раствора Н2О2 и добавляют каплю крови. Жидкость вспенивается, так как происходит бурное выделение пузырьков кислорода.
Результат занести в таблицу 14.
Таблица 14
| № | Фермент | Субстрат | Реакция, катализируемая ферментом | Выявление действия фермента |
Лабораторная работа №19
ДЕЙСТВИЕ ЛИПАЗЫ НА ЖИРЫ
Липаза ускоряет гидролиз нейтрального жира. У человека она содержится в небольшом количестве в желудке; главным же образом липаза входит в состав сока поджелудочной железы. Желудочная липаза может действовать только на предварительно эмульгированные жиры, например на жир молока.
В кишечнике желчные кислоты и белки способствуют эмульгированию липидов и тем самым активируют действие липазы поджелудочной железы.
ПРИНЦИП РАБОТЫ:
Липазу открывают, добавив ее раствор к молоку, подщелоченному раствором карбоната натрия до бледно-розовой окраски на фенолфталеин. В присутствии липазы происходит гидролитическое расщепление жира молока на глицерин и жирные кислоты, реакция среды сдвигается в кислую сторону, розовая окраска исчезает.
РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:
1) вытяжка из препарата поджелудочной железы или 5 % раствор панкреатина; 2) сухие сливки, 5 % раствор; 3) фенолфталеин, 1 % спиртовой раствор; 4) карбонат натрия, 1 % раствор; 5) бюретки; 6) пробирки; 7) пипетки; 8) водяная баня; 9) термометры.
ХОД РАБОТЫ:
В 2 пронумерованные пробирки наливают по 10 капель 5 % раствора сухих сливок. В пробирку №1 добавляют 5 капель вытяжки из поджелудочной железы или раствор панкреатина, содержащий липазу. В пробирку №2 добавляют такое же количество воды. В обе пробирки приливают по 1 капле 1 % раствора фенолфталеина и по каплям 1 % раствор карбоната натрия до появления бледно-розовой окраски (нельзя добавлять избыток раствора карбоната натрия). Пробирки помещают в водяную баню или термостат при температуре 38 оС на 30 минут. Наблюдают изменение окраски.
Результаты занести в таблицу 15.
Таблица 15
| № | Фермент | Субстрат | Окраска на фенолфталеин | ВЫВОД | |
| исходная | конечная | ||||
Лабораторная работа №20
