Наиболее распространенным методом количественного определения белка является метод, основанный на биуретовой реакции, с последующей фотометрией цветных продуктов реакции. Биуретовая реакция открывает пептидную связь в белке.
Метод оценки количества вещества базируется на использовании калибровочного графика, а также концентрации стандартных проб, обрабатываемых параллельно с опытными в одинаковых с ними условиях.
Построение калибровочного графика:
1. Построение калибровочной кривой начинается с приготовления ряда разведений стандартного раствора исследуемого вещества. Стандартный раствор содержит вещество в известной концентрации. Разведения стандартного раствора должны охватывать диапазон физиологических концентраций и выходить за пределы их минимальных и максимальных величин.
(!) Например, при исследовании содержания белка в сыворотке крови концентрация стандартного вещества (альбумина) должна быть в интервале от 40 до 120 г/л (при физиологической концентрации общего белка 65-85 г/л).
Ряд калибровочных разведений получают путем разбавления основного стандартного раствора.
2. Затем ведут обработку стандартных растворов аналогично опытным пробам. Измеряют оптическую плотность калибровочных растворов и опытной пробы на одном и том же приборе. Измерения оптической плотности начинают со стандартного раствора наименьшей концентрации.
3. Усредненные (соответствующие отдельным концентрациям) значения оптической плотности - D (абсорбции - А, экстинкции - Е) наносят на миллиметровую (калибровочную) бумагу. На оси абсцисс (горизонтальной) с соблюдением одинаковых интервалов в равномерно возрастающей концентрации откладывают показатели содержания вещества в стандартном растворе; на оси ординат (вертикальной) - соответствующие им величины оптической плотности (рисунок 5).
Зависимость между концентрацией вещества в стандартных (калибровочных) пробах и оптической плотностью, соответствующей этим пробам, отражается линией, построенной по точкам. Строить калибровочный график следует не менее чем по пяти точкам.
Калибровочная кривая прокладывается таким образом, чтобы по возможности большее число точек (например, 3 из 5) лежало на линии, а остальные располагались близ нее, равномерно отклоняясь в ту и другую стороны. Отдельные точки, значительно смещающиеся от калибровочной кривой и обычно являющиеся результатом грубой ошибки в определении, исключаются из учета.
Расположение кривой определяют так, чтобы она исходила из нулевой отметки под углом ~45 ° к осям координат: при этом достигается наибольшая точность измерений. Последней способствует также выбор оптимального, достаточно крупного масштаба.
Определение количества вещества в опытной пробе с использованием калибровочного графика:
1. Определение оптической плотности раствора вещества с неизвестной концентрацией (опытной пробы). Исследование проводят против контроля, либо, если опытная проба слабоокрашенная, смотрят против дистиллированной воды.
2. Полученное значение откладывают на калибровочном графике путем опускания перпендикуляров: - с оси ординат на калибровочную кривую; - с кривой на ось абсцисс.
3. Полученное в результате значение концентрации на оси абсцисс и является искомой концентрацией.
Рисунок 5. Схема построения калибровочного графика.
Лабораторная работа №8
