Чтобы приготовить наиболее качественные питательные среды, необходимо использовать химически чистые реагенты, чистую посуду и свежеприготовленную стерильную дистиллированную воду. Следует тщательно выполнять рекомендации по приготовлению питательных сред и не вносить в стандартную процедуру никаких модификаций. Ниже приведено несколько советов, которые позволяют приготовить высококачественные питательные среды и помогают предупредить их контаминацию.
Рабочие помещения необходимо содержать в максимальной чистоте, рабочие столы обрабатывать дезинфицирующими растворами (например, 5%-м раствором этилового спирта) до того, как разместить на них стерильные реактивы и питательные среды.
Необходимо использовать стерильную стеклянную посуду.
Необходимо использовать химически чистые реагенты и химикалии (если инструкцией не предусмотрена другая степень их чистоты).
Необходимо контролировать температуру в сухожаровом шкафу и водяной бане.
В процессе приготовления питательных сред необходимо строго соблюдать правила асептики – например, обжигать на пламени горелки горло флаконов и пробирок, так как свертывание является не стерилизующей, а лишь коагулирующей процедурой.
При приготовлении яичных сред необходимо всегда тщательно очищать поверхность скорлупы яйца перед ее вскрытием.
Не следует перегревать питательные среды в процессе тепловой обработки.
Качество приготовленной яичной среды зависит от соблюдения температурного и временного режимов коагуляции. Обесцвечивание среды, наличие пузырьков или углублений на ее поверхности свидетельствует о нарушении режима свертывания. Повторное свертывание также ухудшает качество среды. Среды с нарушенным режимом свертывания подлежат удалению.
Не следует оставлять приготовленные питательные среды на свету (в том числе не подвергать воздействию ультрафиолетовых лучей); среды до употребления следует хранить в холодильнике в темноте.
Не следует экономить на объеме питательной среды. Следует вносить в каждую пробирку 5 мл среды.
Некачественные питательные среды следует просто выбрасывать.
Приготовление яичных сред
Среда Левенштейна-Йенсена
Среда Левенштейна-Йенсена применяется во всем мире в качестве стандартной среды для первичного выделения возбудителя туберкулеза и определения его лекарственной чувствительности. Эта среда рекомендуется для использования всеми микробиологическими лабораториями противотуберкулезной службы Республики Беларусь для получения сравнимых результатов. Это плотная яичная среда, на которой хороший рост микобактерий туберкулеза получают на 15–25-й день после посева микроскопически положительного материала.
В состав этой питательной среды входит глицерин, который способствует росту M.tuberculosis. Для культивирования M.bovis среду Левенштейна-Йенсена обогащают 0,5% пируватом натрия, исключив из солевого раствора глицерин. С этой целью в состав солевого раствора вместо глицерина добавляют 8,0 г пирувата натрия. Применение этой модификации среды рекомендуется в тех территориях, где возможно распространение M.bovis.
Реактивы:
Калий однозамещенный фосфорнокислый (KH2PO4);
Магний лимоннокислый (Mg3(C6H5O7)2 x 14H2O);
Магний сернокислый (MgSO4 x 7H2O);
L -аспарагин (C4H8N2O3 x H2O);
Глицерин (C3H8O3);
Малахитовый зеленый (C52H54O12N4);
Вода дистиллированная.
Состав среды:
Раствор минеральных солей:
KH2PO4 - 2,4 г,
Mg3(C6H5O7)2 x 14H2O - 0,24 г
Mg3(C6H5O7)2 x 14H2O - 0,6 г
L -аспарагин - 3,6 г
Глицерин - 12,0 мл
Вода дистиллированная - 600 мл
Ингредиенты растворяют в дистиллированной воде в указанной последовательности при слабом подогревании (не доводя до кипения) на водяной бане. Затем стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм. (112°С) в течение 30 минут. Срок хранения раствора составляет 3–4 недели при комнатной температуре.
Раствор малахитового зеленого:
Малахитовый зеленый – 2 г
Вода дистиллированная – 100 мл
Малахитовый зеленый растворяют в стерильной дистиллированной воде, поместив раствор в термостат на 1–2 часа. Стерилизуют при 0,5 атм. (112°С) в течение 20 минут. Приготовленный раствор не подлежит длительному хранению, и при появлении осадка или изменении окраски его следует заменить свежим раствором.
Яичная масса:
Свежие диетические куриные яйца со сроком хранения не более 7 суток без трещин и дефектов скорлупы тщательно отмывают в теплой проточной воде с помощью ручных щеток и щелочного мыла, оставляют на 30 мин в мыльном растворе. Тщательно промывают в проточной воде и погружают в 70° этиловый спирт на 30 мин. Затем в стерильном боксе разбивают яйца стерильным ножом в стерильную посуду, доводя общий объем яичной массы до 1 л (для этого требуется в среднем 20–25 яиц в зависимости от их величины). Тщательно гомогенизируют в стерильном миксере.
Приготовление среды.
В большую стерильную емкость вносят 600 мл раствора минеральных солей, 1000 мл гомогенизированной яичной массы, тщательно перемешивают и фильтруют через четырехслойный стерильный марлевый фильтр. Добавляют 36 мл раствора малахитового зеленого, тщательно перемешивают, избегая образования пены,разливают в пробирки приблизительно по 5 мл, следя за тем, чтобы в растворе не образовался осадок. Для предупреждения выпадения осадка флаконы или пробирки с яичной средой подвергают тепловой обработке не позже чем через 15 минут после разлива среды.
Свертывание среды.
Пробирки с разлитой в них средой помещают в штативы со специально подобранным углом наклона для формирования скошенной среды. Штативы устанавливают в свертыватель и проводят коагуляцию при 80°С в течение 45 минут.
Контроль стерильности:
После свертывания каждую вновь приготовленную партию среды подвергают контролю на стерильность. Для этого несколько пробирок со средой из партии помещают в термостат и выдерживают в нем 2–3 суток при 37°С.
Хранение:
На пробирках с приготовленной партией среды указывают дату изготовления. Среду хранят в холодильнике при 4°С с тщательно закрытыми пробками для предотвращения высыхания. Срок хранения среды не должен превышать 4 недели
5.3.2. Среда Финн-II
Среда Финн-II рекомендована как вторая стандартная среда для выделения микобактерий. Она отличается от среды Левенштейна-Йенсена тем, что вместо L -аспарагина в ней используется глутамат натрия, и подбор солей рассчитан таким образом, что конечная кислотность среды (рН 6,3–6,8) имеет более низкое значение и большую стабильность по сравнению со средой Левенштейна-Йенсена. Эти свойства обусловливают более высокую эффективность среды при посеве материала, обработанного щелочными детергентами. Рост микобактерий появляется на этой среде на несколько дней раньше, чем на среде Левенштейна-Йенсена, а выделение культур на 6–8% выше.
Реактивы:
Магний сернокислый (MgSO4 x 7H2O);
Натрий лимоннокислый (C6H5O7Na3 x 5,5H2O);
Квасцы железоаммонийные (Fe(NH4)•(SO4)2 x 12 H2O);
Калий однозамещенный фосфорнокислый (KH2PO4);
Аммоний лимоннокислый однозамещенный (C8H11O7N);
Натрий глутаминовокислый однозамещенный (C5H8NNaO4 x H2О);
Глицерин (C3H8O3);
Малахитовый зеленый (C52H54O12N4);
Вода дистиллированная.
Состав среды:
Раствор минеральных солей:
MgSO4 x 7H2O - 0,5 г
C6H5O7Na3 x 5,5H2O - 0,1 г
Fe(NH4)•(SO4)2 x 12 H2O - 0,05 г
KH2PO4 - 20 г
C8H11O7N - 5 г
C5H8NNaO4 x H2О - 10 г
Глицерин - 20 мл
Вода дистиллированная - до 1000 мл
Ингредиенты растворяют в дистиллированной воде в указанной последовательности при слабом подогревании (не доводя до кипения) на водяной бане. Кислотность не корригируют. Стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм. (112°С) в течение 30 минут. Срок хранения раствора составляет 3-4 недели при комнатной температуре.
Раствор малахитового зеленого:
Малахитовый зеленый – 2 г
Стерильная дистиллированная вода – 100 мл.
Малахитовый зеленый растворяют в стерильной дистиллированной воде, поместив раствор в термостат на 1–2 часа. Приготовленный раствор не подлежит длительному хранению, и при появлении осадка или при изменении окраски его следует заменить свежим раствором. Стерилизуют при 0,5 атм. (112°С) в течение 20 мин.
Яичная масса:
Свежие диетические куриные яйца со сроком хранения не более 7 суток без трещин и дефектов скорлупы тщательно отмывают в теплой проточной воде с помощью ручных щеток и щелочного мыла, оставляют на 30 мин в мыльном растворе. Тщательно промывают в проточной воде и погружают в 70% этиловый спирт на 30 мин. Затем в стерильном боксе разбивают яйца стерильным ножом в стерильную посуду, доводя общий объем яичной массы до 1 л (для этого требуется в среднем 20–25 яиц в зависимости от их величины). Тщательно гомогенизируют в стерильном миксере.
Приготовление среды.
В большую стерильную емкость вносят 600 мл раствора минеральных солей, 1000 мл гомогенизированной яичной массы, тщательно перемешивают и фильтруют через четырехслойный стерильный марлевый фильтр. Добавляют 36 мл раствора малахитового зеленого, тщательно перемешивают, избегая образования пены,разливают в пробирки приблизительно по 5 мл, следя за тем, чтобы в растворе не образовался осадок. Для предупреждения выпадения осадка флаконы или пробирки с яичной средой подвергают тепловой обработке не позже чем через 15 минут после разлива среды.
Свертывание среды.
Пробирки с разлитой в них средой помещают в штативы со специально подобранным углом наклона для формирования скошенной среды. Штативы устанавливают в свертыватель и проводят коагуляцию при 85°С в течение 30 минут.
Контроль стерильности:
После свертывания каждую вновь приготовленную партию среды подвергают контролю на стерильность. Для этого несколько пробирок со средой помещают в термостат и выдерживают в нем 2–3 суток при 37°С.
Хранение:
На пробирках с приготовленной партией среды указывают дату изготовления. Среду хранят в холодильнике при 4°С с тщательно закрытыми пробками для предотвращения высыхания. Срок хранения среды не должен превышать 4 недели
Среда Школьниковой
В повседневной работе микробиологической лаборатории наряду с плотными питательными средами могут использоваться и жидкие. Хорошо зарекомендовала себя жидкая питательная среда Школьниковой.
Реактивы:
Калий однозамещенный фосфорнокислый (KH2PO4);
Натрий двузамещенный фосфорнокислый (Na2HPO4);
Магний сернокислый (MgSO4 x 7H2O);
Натрий лимоннокислый (C6H5O7Na3 x 5,5H2O);
Лимоннокислое аммиачное железо (FeNH4C6H507);
L -аспарагин (C4H8N2O3 x H2O);
Глицерин (C3H8O3);
Вода дистиллированная.
Состав среды:
KH2PO4 - 1,5 г
Na2HPO4 - 2,5 г
MgSO4 x 7H2O - 0,5 г
C6H5O7Na3 x 5,5H2O - 1,5 г
FeNH4C6H507 - 0,05 г
L -аспарагин - 1,0 г
Глицерин - 30 мл
Вода дистиллированная - до 1000 мл
Приготовление среды.
Ингредиенты растворяют в дистиллированной воде в указанной последовательности при слабом подогревании (не доводя до кипения) на водяной бане. Среду фильтруют через бумажный фильтр и разливают в колбы. Кислотность среды не корригируют, так как она содержит буферную смесь солей с рН среды 7,0–7,2.
Стерилизуют в автоклаве при 1 атмосфере (121°С) в течение 30 минут.
Хранение:
На пробирках с приготовленной партией среды указывают дату изготовления. Среду хранят в холодильнике при 4°С с тщательно закрытыми пробками для предотвращения высыхания. Срок хранения среды составляет 2-3 месяца.
