Поступивший в лабораторию материал перед обработкой и посевом должен быть зарегистрирован в лабораторном регистрационном журнале. Каждой пробе материала необходимо присвоить порядковый регистрационный лабораторный номер, который должен использоваться при всех последующих лабораторных исследованиях.
Правила работы с инфекционным материалом изложены в инструкции «Требования к биологической безопасности при работе в бактериологических лабораториях противотуберкулезных учреждений».
Особенностью M.tuberculosis является способность их долгое время находиться в жидкостях во взвешенном состоянии, поэтому все жидкие материалы подлежат обязательному центрифугированию. Все последующие манипуляции выполняют с полученным осадком.
Перед посевом исследуемый материал необходимо гомогенизировать и освободить от контаминирующей микрофлоры. Для этого мокроту, экссудаты и другой негомогенный материал собирают в стерильные флаконы, добавляют щелочь или кислоту и подвергают встряхиванию. Процедура предпосевной обработки должна быть максимально щадящей, обеспечивающей частоту контаминации, не превышающую 5%. Режим центрифугирования должен обеспечивать осаждение 95% клеток микобактерий с минимальной гибелью их вследствие нагревания.
Для использования в практике приемлем любой метод предпосевной обработки материала, при использовании которого частота контаминации находится в пределах 2-5%. Интенсивность контаминации проб может варьировать в значительной степени, поэтому необходимо выбирать способ деконтаминации соответственно исследуемому материалу. Выбор метода деконтаминации зависит также от того, как давно была взята проба, и в каких условиях она хранилась и транспортировалась в лабораторию.
Если возникают сомнения в контаминации образцов, можно провести посев части пробы без какой-либо предварительной обработки на неселективную питательную среду (например, на простой питательный агар) и инкубировать в течение 24 часов для того, чтобы проконтролировать наличие в образце контаминирующих бактерий. Остальную часть пробы хранят без какой-либо обработки в холодильнике до тех пор, пока не будет подтверждено отсутствие контаминирующих бактерий. Если при этом будет установлен факт контаминации, оставшуюся часть пробы можно деконтаминировать одним из описанных ниже методов.
Для обработки и посева материала используют только стерильную посуду (баночки, центрифужные пробирки, пипетки и т.д.).
Все реактивы, используемые при приготовлении растворов для обработки диагностических материалов, должны иметь степень очистки не менее категории "химически чистый" (ХЧ). Для предпосевной обработки диагностического материала используют только стерильные растворы детергентов, щелочей и кислот.
Обработка мокроты
4.1.1. Обработка 10% раствором трехзамещенного фосфорнокислого натрия
Трехзамещенный фосфорнокислый натрий (Na3PO4) хорошо подавляет сопутствующую флору и даже при 2–3-х-дневном хранении материала при +4°С не повреждает микобактерии и мало влияет на их способность к росту на питательных средах.
Обработку материала 10% раствором трехзамещенного фосфорнокислого натрия производят следующим образом:
Исследуемый материал, находящийся в стерильном флаконе, заливают равным объемом 10% трехзамещенного фосфата натрия и помещают на 10 мин во встряхиватель, затем на 18–20 часов в термостат при 37°C. После этого материал центрифугируют при 3000 g в течение 15 минут. При указанном режиме происходит осаждение 95% присутствующих в материале микобактерий.
Надосадочную жидкость отбирают, осадок отмывают 10–15 мл изотонического раствора NaCl или дистиллированной воды.
Супернатант удаляют, а осадок в объеме 0,8–1,0 мл засевают на питательную среду с параллельным приготовлением мазка.
Реактивы.
Трехзамещенный фосфорнокислый натрий (Na3PO4)
Кислота соляная (HCl) концентрированная;
Бумага индикаторная универсальная.
Приготовление растворов.
1. 10% раствор трехзамещенного фосфата натрия. 100 г трехзамещенного фосфата натрия растворяют в 800 мл дистиллированной воды и доводят объем раствора до 1 л.
2. 6% соляная кислота. 6 мл концентрированной соляной кислоты добавляют к 94 мл дистиллированной воды. Никогда не добавлять воду в кислоту!
4.1.2. Обработка 3% серной кислотой
Длительная экспозиция материала в растворе серной кислоты губительно действует на микобактерии, поэтому общее время обработки кислотой не должно превышать 20 минут. Раствором серной кислоты производят обработку материала, содержащего большое количество сопутствующей микрофлоры: мочи, гнойных экссудатов и отделяемого ран, резецированных тканей, органов экспериментальных животных и пр.
Обработку материала 3% серной кислотойпроизводят следующим образом:
К исследуемому материалу добавляют равный объем 3% раствора серной кислоты, перемешивают, выдерживают в течение 10 мин при комнатной температуре, не превышая время экспозиции.
Пробу центрифугируют при 3000 g в течение 10 мин, не превышая время экспозиции. Надосадочную жидкость отбирают, к осадку добавляют 15 мл стерильного 0,9% раствора хлористого натрия. Пробирки повторно центрифугируют при 3000 g в течение 15 мин.
Надосадочную жидкость отбирают, к осадку добавляют 1–2 капли 4% едкого натра до получения нейтрального значения рН, определяемого индикаторной бумажной полоской.
Осадок в объеме 0,8–1,0 мл засевают на питательную среду с параллельным приготовлением мазка.
Реактивы:
1. Серная кислота (H2SO4) концентрированная;
2. Едкий натр (NaOH).
Приготовление растворов
1. 3% раствор серной кислоты. К 97 мл дистиллированной воды добавляют 3 мл концентрированной серной кислоты, осторожно наслаивая ее по стенкам сосуда. Никогда не добавлять воду в кислоту! Нельзя пипетировать концентрированную серную кислоту ртом!
2. 4% раствор едкого натра.40 г NaOH заливают дистиллированной водой до объема 1л.
4.1.3. Обработка 4% раствором едкого натра (модифицированный метод Петрова)
Обработка с помощью NaOH является достаточно жесткой и может приводить к гибели до 60% микобактерий, содержащихся в исследуемом образце материала, поэтому общее время обработки материала щелочью не должно превышать 40 минут. Данный показатель не зависит от дополнительной гибели бактерий за счет повышенной температуры при центрифугировании и других факторов. Поэтому при использовании данного метода необходимо строго соблюдать указанное время обработки.
Обработку материала 4% раствором едкого натра производят следующим образом:
Исследуемый материал заливают двойным объемом 4% раствора едкого натра и помещают на 10 мин во встряхиватель, затем выдерживают 15 мин при комнатной температуре с периодическим ручным встряхиванием, не превышая время экспозиции. После этого материал центрифугируют при 3000 g в течение 15 мин.
Надосадочную жидкость отбирают, к осадку добавляют 15 мл стерильного 0,9% раствора хлористого натрия, пробы центрифугируют при 3000 g в течение 15 мин.
Надосадочную жидкость отбирают, к осадку добавляют 1–2 капли 10% раствора соляной кислоты до получения нейтрального значения рН, определяемого индикаторной бумажной полоской.
Осадок в объеме 0,8-1,0 мл засевают на питательную среду с параллельным приготовлением мазка.
Реактивы.
1. Едкий натр (NaOH);
2. Кислота соляная (HCl) концентрированная;
Приготовление растворов.
1. 4% раствор едкого натра.К40 г едкого натра добавляют дистиллированную воду до объема 1 л.
2. 10% раствор соляной кислоты. 10 мл концентрированной соляной кислоты добавляют к 90 мл дистиллированной воды.
