Утверждено
приказ Министерства здравоохранения Республики Беларусь
«»2004 г. №
ИНСТРУКЦИЯ
ПО УНИФИЦИРОВАННЫМ МЕТОДАМ
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА
ИНСТРУКЦИЯ ПО УНИФИЦИРОВАННЫМ МЕТОДАМ
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА
ОБОРУДОВАНИЕ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ
Общие требования.
Оборудование бактериологической лаборатории должно полностью удовлетворять стандартным требованиям и спецификациям. Пользоваться оборудованием нужно в строгом соответствии с инструкциями по его применению.
Технические паспорта всего оборудования и инструкции по применению оборудования и уходу за ним необходимо хранить в специальной папке.
Для обеспечения точности и правильности работы оборудование должно регулярно проверяться специалистом соответствующего профиля.
Для регистрации профилактических осмотров всего оборудования следует иметь отдельный журнал.
В случае возникновения неисправности в работе того или иного прибора работа на нем немедленно прекращается, и прибор консервируется до прихода специалиста по ремонту и эксплуатации данного прибора.
Перед тем как приобретать новое оборудование и материалы, целесообразно посоветоваться со специалистом, имеющим личный опыт работы с этим оборудованием. Не следует полагаться целиком на рекламные объявления, каталоги, преувеличенные утверждения торговых представителей.
Ниже приведен перечень основного оборудования для лаборатории, производящей бактериологические исследования на микобактерии туберкулеза на яичных питательных средах:
Весы аналитические или торсионные
Автоклавы (2)
Бокс 2-го класса защиты (ламинарный шкаф)
Дистиллятор
Холодильник
Шкаф сухожаровой
Аппарат для свертывания питательных сред (аппарат для свертывания и инактивации сыворотки (АСИС))
Центрифуга с крышкой мощностью 3000 g
Мешалка настольная
Термостат на 35-37оС (термостатная комната)
Плитка электрическая
Микроскоп бинокулярный с иммерсионным объективом (100х), окуляром 8х или 10х
Облучатели бактерицидные
Необходимое количество оборудования определяется в соответствии со спецификой и объемом работы лаборатории.
Основное оборудование
Ламинарный шкаф (защитный бокс с ламинарным потоком воздуха)
Самой важной частью оборудования лаборатории, осуществляющей культуральную диагностику туберкулеза, является хорошо функционирующий, надежный и удобный ламинарный шкаф. При правильном использовании и применении соответствующих методов ламинарные шкафы обеспечивают создание безопасных условий работы персонала, а также защиту окружающей среды и исследуемых проб от загрязнения. В таких шкафах используются высокоэффективные фильтры при вытяжной и/или приточной вентиляции. Эти фильтры обеспечивают очистку воздуха от частиц, имеющих в диаметре не менее 0,3 мкм (все бактерии, споры и вирусы имеют больший диаметр), причем эффективность очистки достигает 99,97%. Общая характеристика ламинарных шкафов приведена в инструкции по биологической безопасности при работе в бактериологических лабораториях противотуберкулезных учреждений.
Высокая стоимость ламинарных шкафов ограничивает широкое использование этого оборудования. Тем не менее, следует стремиться к оснащению бактериологических лабораторий боксами биологической безопасности.
Центрифуга
В лаборатории, осуществляющей выделение культур микобактерий туберкулеза, целесообразно использовать напольную центрифугу с крышкой и фиксированными в роторе закрывающимися гнездами для центрифужных пробирок. Обычно крышки гнезд ротора изготовлены из нержавеющей стали и снабжены резиновыми прокладками. Желательно, чтобы центрифуга была оборудована специальным замком, который предупреждает случайное открывание крышки, пока вращается ротор. Центрифуги следует размещать в специальных комнатах или боксах, имеющих вентиляцию.
Во многих книгах и руководствах описаны методы обработки мокроты при исследовании на туберкулез с указанием скорости вращения ротора, а именно – количества оборотов в минуту (об/мин). Однако эта величина показывает только скорость вращения ротора данной центрифуги, но не характеризует интенсивность осаждения (седиментации), или относительную силу центрифугирования (ОСЦ). Величина искусственной силы тяжести, создаваемой вращающимся ротором, зависит от скорости вращения ротора (об/мин) и от расстояния от оси вращения до точки, в которой производится измерение этой силы. Относительную силу тяжести можно увеличить или путем увеличения скорости вращения ротора, или посредством увеличения расстояния от оси ротора до центрифугируемой жидкости.
ОСЦ измеряется в относительных единицах к ускорению свободного падения (g), например, 3000 g. Для расчета ОСЦ можно использовать следующую формулу:
ОСЦ =1,12R max (об/мин / 1000)2,
где Rmax – радиус, т.е. расстояние от центра вращающегося ротора до дна центрифужной пробирки в миллиметрах. Например, при R= 180 мм и скорости вращения 1500 об/мин ОСЦ=450 g. При увеличении частоты вращения до 3000 об/мин ОСЦ возрастает до 1800 g.
Скорость вращения ротора, необходимую для получения требующейся ОСЦ, можно определить по следующей формуле:
Об/мин = 1000√(ОСЦ / (1,12 R max))
Например, при R= 180 мм для получения ОСЦ, равной 3000 g, скорость вращения ротора должна составлять 3900 об/мин.
Если величина ОСЦ будет недостаточной, многие микобактерии после центрифугирования останутся в суспензии и будут удалены вместе с надосадочной жидкостью. Для получения оптимального результата при выделении культуры микобактерий необходимо добиться осаждения 95% бактериальных клеток. Для этого требуется использовать ОСЦ, равную 3000 g. Многие старые центрифуги, до сих пор используемые в бактериологических лабораториях, имеют скорость вращения ротора не более 2300–3000 об/мин, т.е. позволяют получить ОСЦ, равную всего лишь 1500–2000 g. Большинство лабораторий, применяющих такие центрифуги, обрабатывают исследуемые пробы в течение 15 минут, что позволяет добиться осаждения не более 75 –84%бактерий.
В зависимости от типа ротора в нерефрижераторной центрифуге и скорости его вращения температура воздуха в центрифуге и соответственно температура исследуемого образца может повышаться на 4–18°С. При этом температура образца в угловом роторе меняется незначительно, однако температура содержимого пробирки в крестовине с отклоняющимися центрифужными стаканами может превышать 40°С, если центрифуга используется повторно 5 раз и более. В этом случае, даже если время центрифугирования образца не превышает 15 минут, количество погибающих бактерий может возрасти с 13% при комнатной температуре 20°С до 22–30% при увеличении температуры до 30–40°С. Поэтому чрезвычайно важно центрифугировать исследуемые образцы в течение фиксированного времени (15 минут) и использовать высокую ОСЦ (3000g) для достижения 95% седиментации. Применение угловых роторов позволяет свести до минимума нагревание образца, обусловленное сопротивлением воздуха.
Кроме того, увеличение времени центрифугирования, которое предпринимается для лучшего осаждения микобактерий при работе на центрифугах с невысокой скоростью вращения ротора, приводит к более длительному контакту проб диагностического материала с деконтаминирующим раствором, что может снижать количество жизнеспособных микобактерий в образце.
Под воздействием центробежной силы стеклянные пробирки могут разрушиться. При этом происходит разбрызгивание жидкости и образование аэрозоля. Поэтому при обработке потенциально инфекционного материала предпочтительно использовать пластиковые пробирки с завинчивающимися пробками. Ротор центрифуги перед началом работы должен быть хорошо уравновешен. Если этого не сделать, может возникнуть сильная вибрация, которая приведет к разрушению ротора. Если проводится исследование одной пробы, то с противоположной стороны ротора должна быть помещена аналогичная пробирка, имеющая такую же массу. В качестве дополнительной меры предосторожности можно использовать такой прием: в уравновешивающую пробирку наливают не воду, а 70% этиловый спирт; это снижает риск лабораторного заражения в случае повреждения пробирки.
Нельзя прикасаться к ротору, который еще продолжает вращаться, так как это не только может послужить причиной травмы, но и привести к ресуспендированию осадка из-за резкой остановки пробирки. Некоторые центрифуги оборудованы специальным тормозом, который обеспечивает плавную остановку ротора.
Термостат с температурой 35–37°С
Инкубацию посевов производят при температуре 35–37°С в течение 10 недель. Существуют лабораторные термостаты различных размеров. Как правило, лучше всего приобрести самую большую модель, какую можно без проблем разместить в лаборатории и на какую имеются средства. В термостатах с маленьким объемом при открывании дверцы происходят резкие колебания температуры воздуха. Старайтесь обеспечить внутри термостата правильную циркуляцию воздуха, не перегружая термостат и используя не сплошные, а решетчатые полки. Поддерживайте постоянную температуру, избегая ненужного открывания термостата. Электрооборудование термостата обычно устроено очень просто, тем не менее, для его ремонта следует приглашать специалиста.
В лабораториях с большими объемами культуральных исследований целесообразно использовать термостатную комнату. К нагревательному элементу термостатной комнаты должен быть подключен чувствительный датчик. Рекомендуется иметь два датчика: один на 37°С – для стабильного поддержания необходимой рабочей температуры, и второй (запасной) на 39°С – для предупреждения перегревания помещения и гибели культур в случае выхода из строя первого датчика.
Нецелесообразно использовать деревянные полки и перегородки. При высокой влажности воздуха на них могут расти плесневые грибы. Более предпочтительны металлические или пластиковые полки, которые могут быть изготовлены непосредственно на месте. Полки должны быть нефиксированы, чтобы их можно было легко удалять и мыть. Между полками и стенами помещения следует оставить зазоры для обеспечения хорошей циркуляции воздуха.
Аппарат для свертывания питательных сред
При приготовлении яичных сред приходится использовать оборудование, позволяющее точно дозировать количество тепла для обеспечения коагуляции белка.
Аппарат для свертывания питательных сред должен обеспечивать нагревание до температуры 80–85°С и поддержание такой температуры в течение 45 минут. Современные свертыватели имеют автоматическую регулировку температуры и оснащены большим внутренним вентилятором. Внутренние полки, на которых размещаются пробирки в наклонном положении, должны быть изготовлены из проволоки, чтобы не препятствовать циркуляции горячего воздуха. Свертыватель должен иметь плотно закрывающуюся стеклянную дверцу, которая обеспечивает поддержание внутри необходимой температуры.
Автоклав
Микобактерии туберкулеза быстрее погибают в условиях высокой температуры и влажности (насыщенный пар), чем при использовании сухого жара. Пар убивает микобактерии туберкулеза, денатурируя их белки. Существенное влияние на эффективность стерилизации паром оказывает воздух, так как его присутствие изменяет соотношение между давлением и температурой. Например, температура насыщенного пара при давлении 100 КПа составляет 121°С, но только в том случае, если предварительно воздух был удален из автоклава. Если же будет удалена только половина воздуха, температура паровоздушной смеси составит всего лишь 112°С. Кроме того, наличие воздуха между помещенными в автоклав предметами будет препятствовать проникновению пара в эти пространства. Весь воздух, находящийся в автоклаве, до начала процесса стерилизации паром должен быть удален. Поэтому подлежащий стерилизации материал не следует слишком плотно упаковывать. Между контейнерами следует оставить как можно больше свободного места и ни в коем случае нельзя закрывать контейнеры крышками. Следует использовать только специальные лабораторные автоклавы, в которые можно помещать различную использованную посуду.
