Присутствие кислотоустойчивых бактерий в клиническом диагностическом материале может быть подтверждено или микроскопией, или культуральным исследованием. Поскольку микобактерии не могут быть точно идентифицированы при микроскопическом исследовании, и поскольку существует много видов микобактерий, окончательный диагноз туберкулез или микобактериоз (за исключением лепры) может быть установлен только при выделении Mycobacterium из клинического образца.
Кратность и сроки микробиологических исследований в ходе лечения и наблюдения различных групп пациентов определены в инструкциях по химиотерапии больных туберкулезом и организации диспансерного наблюдения и учета контингентов противотуберкулезных учреждений.
Преимущества аккуратной деконтаминации проб, применения высокочувствительных питательных сред и простых схем идентификации выделенных штаммов не будут реализованы до тех пор, пока не будет обеспечено правильное взятие проб и их быстрая и правильная транспортировка в лабораторию.
Для получения оптимальных результатов при исследовании диагностического материала необходимо соблюдать следующие условия:
– сбор материала необходимо производить до начала химиотерапии, так как даже несколько дней применения лекарственной терапии может быть достаточно для того, чтобы убить значительное количество кислотоустойчивых микобактерий или снизить их жизнеспособность и исказить результаты исследования;
– материал для исследования должен собираться рано утром ;
– при исследовании мокроты желательно собрать не менее 3 проб утренней мокроты в течение 3 последовательных дней. Это существенно повышает результативность исследования;
– собранный материал необходимо как можно быстрее доставить в лабораторию; в случае невозможности немедленной доставки материал сохраняется в холодильнике при 4-10°С не более 48 часов;
– при перевозке материала необходимо особенно тщательно следить за сохранностью флаконов и правильностью их маркировки.
Флаконы для сбора материала.
Материал для исследования на кислотоустойчивые микобактерии собирают в стерильные флаконы (баночки). Эти флаконы должны быть достаточно прочными, чтобы предупредить возможность их повреждения при транспортировке, и иметь широкую герметично закрывающуюся крышку, чтобы избежать вытекания материала и его загрязнения. Чтобы облегчить выбор оптимальных флаконов, необходимо помнить о следующих основных требованиях к ним:
- широкое горлышко (диаметром не менее 35 мм), чтобы больному было удобно собирать мокроту, не загрязняя наружной поверхности флакона;
- емкость флакона - около 50 мл;
- флакон должен быть из прозрачного материала, чтобы было можно определить объем пробы и ее качество, не открывая крышку;
- крышка должна быть плотно завинчивающейся или герметично закрывающейся, чтобы предотвратить вытекание потенциально опасного материала в процессе транспортировки;
- наружная поверхность не должна быть чрезмерно гладкой и скользкой, чтобы можно было легко маркировать флаконы;
- желательно использовать одноразовые флаконы, изготовленные из легкосжигаемого материала;
- при отсутствии одноразовых контейнеров можно применять толстостенные флаконы из стекла.
Сбор проб
Поскольку наиболее частой формой туберкулезного поражения является туберкулез органов дыхания, основной материал исследования составляют мокрота; отделяемое верхних дыхательных путей, полученное после аэрозольных ингаляций; промывные воды бронхов; бронхоальвеолярные смывы; материал, получаемый при бронхоскопии, транстрахеальной и внутрилегочной биопсии; аспират из бронхов; ларингеальные мазки; экссудаты; мазки из торакальных ран; промывные воды желудка (преимущественно у детей).
Мокрота
Хотя M.tuberculosis могут вызывать поражение практически любого органа и любой системы, более 85% больных в странах с высокой распространенностью туберкулеза страдают легочной формой заболевания. Поэтому при проведении исследований на туберкулез основным клиническим материалом является мокрота, которую следует собирать у всех больных с подозрением на это заболевание.
Хороший клинический образец – это недавно собранная мокрота из бронхиального дерева, с минимальными примесями слюны или слизи из носоглотки. Качественным материалом можно считать мокроту, имеющую слизистый или слизисто-гнойный характер, а также содержащую плотные белесоватые включения. Желтоватый, серый или бурый цвет мокроты позволяет предположить диагностическую ценность материала. Достаточный объем исследуемой порции мокроты составляет 3 - 5 мл, однако допустимо исследование и меньших по объему порций. Некоторые больные выделяют микобактерии нерегулярно, поэтому в целях повышения информативности практикуется повторное (до 3 раз) исследование мокроты. Такая тактика позволяет повысить число положительных находок.
Необходимо, чтобы лабораторный персонал знал, как следует правильно собирать мокроту. Эта методика описана в инструкции по бактериоскопическому методу диагностики туберкулеза. Лучше всего, если пациент собирает мокроту утром до завтрака и приема лекарств (частицы пищи и лекарства могут препятствовать росту микобактерий туберкулеза). Если предполагается брать пробы мокроты для культуральной диагностики, не следует до этого момента начинать химиотерапию.
Материал для исследования должен быть доставлен в лабораторию сразу же после его сбора. Если транспортировка откладывается, то собранный материал следует обязательно хранить в холодильнике, чтобы предупредить рост контаминирующей микрофлоры.
Образцы мокроты нельзя объединять из-за риска перекрестного загрязнения материала. Всегда проводят обработку (разжижение и деконтаминацию) всей пробы, т.е. не выбирают какие-то части образца, как это обычно делают при бактериоскопическом исследовании мокроты. Так как чаще всего для культурального исследования на туберкулез в лабораторию присылают именно пробы мокроты, разработанные способы разжижения и деконтаминации рассчитаны прежде всего именно на этот биологический материал. Другие биологические жидкости и ткани требуют более тщательной обработки, так как в них обычно содержится меньшее количество микобактерий туберкулеза, чем в мокроте.
Индуцированная мокрота
Если у больного продуктивный кашель, то необходимость сбора мокроты вполне очевидна. Однако, если больной не может собрать мокроту, для получения других биологических материалов из легких можно использовать несколько специальных приемов.
Для аэрозольных ингаляций пользуются портативными или стационарными аэрозольными ингаляторами. Для ингаляций рекомендуется раствор, в 1 л которого содержится 150 г хлорида натрия (NaCl) и 10 г двууглекислого натрия (Na2CO3). Для приготовления раствора используется стерильная дистиллированная вода. Для провокации мокроты необходимо вдохнуть на протяжении 10–15 минут от 30 до 60 мл подогретой до 42–45°С смеси. В связи с тем, что аэрозольная ингаляция вызывает выделение водянистого секрета, напоминающего по консистенции слюну, во избежание выбраковки материала в бланке направления и на флаконе с материалом должна быть обязательная маркировка, указывающая на то, что материал получен после аэрозольной ингаляции.
У большинства пациентов после аэрозольной ингаляции в течение нескольких часов наблюдается остаточная гиперсекреция бронхиального отделяемого, поэтому пациенту рекомендуется в течение суток после ингаляции собрать мокроту для второго исследования.
При отсутствии мокроты, невозможности проведения аэрозольной ингаляции или безуспешности этой процедуры для исследования на микобактерии берут промывные воды бронхов или желудка.
3.2.3. Промывные воды бронхов.
Сбор промывных вод бронхов производится врачом-отоларингологом. Пациенту во время вдоха вводят шприцем в трахею 5–7 мл стерильного изотонического раствора, который вызывает кашлевой рефлекс. Вместе с изотоническим раствором откашливается секрет из глубоких отделов бронхиального дерева. Промывные воды бронхов собирают в стерильный флакон и немедленно направляют в лабораторию.
Пациентам с выраженным глоточным рефлексом указанную процедуру производят после предварительной анестезии надгортанника, гортани и задней стенки глотки.
Промывные воды желудка.
Промывные воды желудка исследуют преимущественно у детей младшего возраста, которые плохо откашливают мокроту и часто проглатывают ее. Во избежание смешивания проглоченной мокроты с пищей промывные воды желудка следует брать натощак. Последний прием пищи должен быть не менее чем за 12 часов до взятия промывных вод желудка. Перед сбором материала для нейтрализации желудочного содержимого больному дают выпить 100–150 мл раствора питьевой соды (1 чайная ложка соды на 1 стакан воды), приготовленного на стерильной дистиллированной воде для исключения возможности попадания в желудок кислотоустойчивых сапрофитов, которые могут содержаться в водопроводной воде. После этого вводят желудочный зонд и собирают содержимое желудка в стерильный флакон. Материал немедленно доставляют в лабораторию и подвергают обработке, чтобы исключить повреждающее влияние на возбудителя содержащихся в материале желудочных ферментов.
Особенно результативен метод получения промывных вод желудка в сочетании с предварительной аэрозольной ингаляцией. Промывные воды желудка следует собирать через 30 мин после аэрозольной ингаляции. Такая комбинация двух указанных методов дает значительно больший процент положительных результатов, чем каждый из них в отдельности. Этот метод получения диагностического материала может оказаться полезным также у пациентов с подавленным кашлевым рефлексом, у которых не удается получить материал даже при провоцирующих ингаляциях.
3.2.5. Другие пробы.
При внелегочных формах заболевания микобактерии могут поражать практически любой орган, поэтому для исследования пригоден самый разнообразный материал: спинномозговая, плевральная, перикардиальная, синовиальная и асцитическая жидкости, кровь, гной, пунктаты костного мозга, резецированные ткани, гнойно-некротические массы, соскобы синовиальных оболочек, биопсийный материал лимфатических узлов и др.
Если у больного заподозрена внелегочная форма туберкулеза, помимо других видов диагностического материала, желательно также исследовать и мокроту, так как это существенно повышает частоту выявления сочетанных легочных и внелегочных форм туберкулеза.
При внелегочных формах процесса можно выделить 2 группы диагностических материалов: асептически полученный материал, обычно свободный от загрязняющей сопутствующей микрофлоры, и заведомо загрязненный материал из открытых очагов поражения, в отношении которого заранее известно, что он контаминирован сопутствующей микробной флорой или собран без соблюдения правил асептики.
3.2.5.1. Асептически собранный материал чаще всего представляет собой полученные при биопсиях или оперативных вмешательствах резецированной ткани того или иного органа, гнойно-некротические массы, грануляции, соскобы синовиальных оболочек, лимфатических узлов или пунктатов их содержимого, а также плевральную, спинномозговую, синовиальную или асцитическую жидкость. Материал помещают в стерильный флакон без консервантов и немедленно доставляют в лабораторию. Если материал не может быть немедленно доставлен в лабораторию, во избежание высыхания к нему добавляют небольшое количество стерильного изотонического раствора и помещают в холодильник при 4-10°С или во флакон с сухим льдом. Биологические жидкости, а также кровь, гной и костный мозг следует брать в стерильный контейнер с соблюдением правил асептики. Если в собранной жидкости могут образоваться сгустки, то предварительно в контейнер следует внести стерильный раствор щавелевокислого натрия (из расчета 0,01–0,02 мл 10% нейтрального раствора оксалата на 1 мл образца биологической жидкости) или раствор гепарина (0,2 мл на 1 мл образца), или равный объем стерильного 3% раствора лимоннокислого натрия.
3.2.5.2.Заведомо загрязненные материалы. К этой категории относится основной и наиболее доступный при мочеполовом туберкулезе материал – моча.
3.2.5.3.1. Моча (средняя часть утренней порции или вся утренняя порция) собирается в стерильную посуду после тщательного туалета наружных половых органов. Анализ мочи на микобактерии должен предусматривать обязательное трехкратное исследование.
Сбор суточной мочи для бактериологического исследования не практикуется. Это объясняется тем, что при накоплении мочи в течение суток невозможно сохранить ее стерильность. Хранение емкости с мочой в холодном месте может привести к выпадению солей, что неблагоприятно отражается на последующей обработке осадка. Кроме того, в моче содержатся бактерицидные продукты, которые могут не только угнетать жизнеспособность микобактерий, но в течение суток даже разрушать микробные клетки. В то же время при длительном хранении мочи невозможно избежать размножения в ней контаминирующей микрофлоры. Ферменты жизнедеятельности этой флоры могут угнетать способность микобактерий к росту. И, наконец, при сборе мочи в течение длительного времени следует иметь в виду возможность попадания в нее кислотоустойчивых сапрофитов, что может привести к диагностическим ошибкам. В этом отношении особенно осторожно должны оцениваться результаты исследования мочи, полученной от мужчин, так как в ней могут обнаруживаться M.smegmatis и другие нетуберкулезные микобактерии, которые ошибочно могут быть приняты за микобактерии туберкулеза.
3.2.5.3.2. Менструальная кровь. Исследование менструальной крови требует особого методического подхода. Наличие в этом материале большого количества протеолитических, фибринолитических и других ферментов обусловливает необходимость незамедлительной доставки материала в лабораторию и тщательной его обработки. Менструальная кровь, с одной стороны, является весьма подходящим материалом для развития контаминирующей флоры, а с другой, обилие ферментов неблагоприятно влияет на жизнеспособность микобактерий. Менструальную кровь следует собирать не тампоном, а вакуумным отсосом или колпачком Кафки. Исследуют ее так же, как кровь или другие материалы с примесью крови.
3.2.5.3.3. Каловые массы собирают в стерильную посуду. Для посева небольшое количество кала (1 г) гомогенизируют в ступке с 3–5 мл дистиллированной воды, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, центрифугируют и исследуют полученный осадок. Бактериологическое исследование кала производят редко, так как обычно положительный результат получить не удается.
3.2.5.3.4. Смывы с поверхностей. Исследование различных поверхностей применяется для контроля качества дезинфекционных мероприятий, а также при обследовании очагов туберкулезной инфекции в эпидемиологических целях. Метод основан на определении загрязненности поверхностей различных предметов микобактериями путем взятия смывов стерильным тампоном из мелкопористой поролоновой губки размером 15 мм х 15 мм х 15 мм.
При заборе материала стерильный поролоновый тампон берут стерильным пинцетом, погружают в пробирку с 5 мл 5% раствора трехзамещенного фосфорнокислого натрия, слегка отжимают о внутреннюю стенку пробирки и производят смыв с поверхности предмета, после чего тампон снова погружают в смачивающий раствор. Пинцет перед очередным смывом стерилизуют обжиганием над пламенем спиртовки.
