Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции.

(Государственный комитет санитарно-эпидемиологического надзора российской федерации москва, 1995 г.)

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ

1. Область применения

Данный документ предназначен для учреждений здравоохранения и санэпиднадзора, использующих метод полимеразной цепной реакции в целях диагностики инфекционных заболеваний.

2. Обоснование необходимости

Благодаря высокой специфичности и чувствительности метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) находит широкое применение в диагностике возбудителей инфекционных заболеваний. Однако ПЦР-диагностика инфекций связана с проблемой, обусловленной высокой чувствительностью метода, - возможностью контаминации.

Попадание в реакционную пробирку следовых количеств положительной ДНК (специфических продуктов амплификации ДНК - ампликонов; ДНК-стандарта, используемой в качестве положительного контроля; положительной ДНК клинического образца) приводит к амплификации в процессе ПЦР специфического фрагмента ДНК и, как следствие, к появлению ложно-положительных результатов.

Сотрудник, занимающийся ПЦР-диагностикой, в своей работе сталкивается с двумя видами контаминации:

1. перекрестная контаминация от пробы к пробе (в процессе обработки клинических образцов или при раскапывании реакционной смеси), приводящая к появлению спорадических ложно-положительных результатов;

2. контаминация продуктами амплификации (ампликонами), имеющая наибольшее значение, поскольку в процессе ПЦР ампликоны накапливаются в огромных количествах и являются идеальными продуктами для реамплификации.

Контаминация следовыми количествами ампликонов посуды, автоматических пипеток и лабораторного оборудования, поверхностей лабораторных столов или даже поверхности кожи сотрудников лаборатории приводит к появлению систематических ложно-положительных результатов.

Как правило, определить источник контаминации бывает очень трудно и требует значительных затрат времени и средств.

Накопленный к настоящему времени опыт работы лабораторий, использующих полимеразную цепную реакцию для диагностики инфекций (ПЦР-диагностические лаборатории) позволяет сформулировать основные требования к планировке таких подразделений и проведению самих анализов. Соблюдение данных требований обеспечиванет исключение возможности контаминации и получения ложно-положительных результатов.

3. Планировка помещений и основные принципы организации работы ПЦР-диагностических лабораторий

1). Лаборатория должна быть разделена на зоны (комнаты) для каждой из стадий ПЦР-диагностики. Следует иметь не менее двух комнат:

- пре-ПЦР-помещение, где проводится обработка клинических образцов, выделение ДНК, приготовление реакционной смеси для ПЦР и постановка ПЦР (при наличии условий два последних этапа рекомендуется также проводить в дополнительном отдельном помещении); в этих помещениях запрещается проводить все другие виды работ с инфекционными агантами (микробиологический анализ, ИФА, другие диагностические тесты и т.д.), ПЦР-диагностика которых проводится в данной лаборатории.

- пост-ПЦР-помещение, где проводится детекция продуктов амплифиации; в пост-ПЦР-помещении допускается использовать другие методы детекции инфекций, диагностика которых проводится в данной лаборатории.

2). Комнату детекции продуктов амплификации (пост-ПЦР-помещение) следует расположить как можно дальше от пре-ПЦР-помещений.

3). Следует исключить движение воздушного потока из пост-ПЦР в пре-ПЦР-помещения.

4). В комнате приготовления реакционной смеси и в комнате обработки клинических образцов должны быть установлены настольные боксы с ультрафиолетовыми лампами.

5). Работа в лаборатории должна быть организована в одном направлении: от пре-ПЦР-помещений к пост-ПЦР-помещению.

6). Каждое помещение ПЦР-диагностической лаборатории должно иметь свой набор реагентов, автоматических пипеток, наконечников, пластиковой и стеклянной посуды, лаборатоного оборудования, халатов и перчаток, используемых только в данном помещении и не выносящихся в другие ПЦР-помещения. Оборудование, материалы и инвентарь в каждой комнате должны иметь соответствующую маркировку.

7). Обработка рабочей одежды из пре- и пост-ПЦР-помещений должна производиться раздельно.

8). Следует однократно использовать перчатки как в комнате обработки клинических образцов, так и в комнате приготовления реакционной смеси и постановки ПЦР.

9). Необходимо однократно использовать пробирки и наконечники для автоматических пипеток. Обязательно менять наконечники при переходе от одной пробы к другой с целью предотвращения перекрестной контаминации в процессе выделения ДНК или при раскапывании реакционной смеси.

10). Необходимо использовать наконечники для автоматических пипеток с аэрозольным барьером (или наконечники с ватными фильтрами, приготовленными в помещении, в котором не ведутся работы с ДНК) при обработке клинических образцов, а также при внесении выделенной ДНК в реакционную пробирку.

11). Каждый сотрудник лаборатории должен иметь персональный набор автоматических пипеток и реагентов.

12). В пре-ПЦР и пост-ПЦР-помещениях лаборатории должны работать разные сотрудники.

13). Клинические образцы должны храниться отдельно от реагентов.

14). Не следует использовать водяные бани, т.к. заполняющая их вода, просачиваясь в недостаточно плотно закрытые пробирки, может стать источником контаминации; следует использовать суховоздушные термостаты.

15). При исследовании материала зараженного или подозрительного на зараженность возбудителями инфекционных заболеваний I-IV групп работа должна проводиться с соблюдением “Санитарных правил СП 1.2.011-94 (Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности)” и “Положения о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, рикетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактерийных токсинов, ядов биологического происхождения”, М., 1980.

16). Необходимо постоянно поддерживать чистоту на рабочем месте:

- каждое помещение должно иметь свой отдельный набор инвентаря для обработки и уборки рабочего места (ватно-марлевые тампоны, пинцет, 70о этанол, дезинфицирующий раствор и т.д.), и источники ультрафиолетового излучения, которые эффективно инактивируют ДНК-матрицы.

- при манипуляциях с клиническим материалом рабочую поверхность до и после исследования обрабатывают дезинфицирующим раствором (указанным для данного возбудителя) и затем 70о этанолом.

- следует обрабатывать рабочую поверхность в комнате приготовления реакционной смеси до работы 70о этанолом с целью борьбы с пылью.

17). Следует полностью исключить проведение в ПЦР-диагностической лаборатории работ, связанных с получением (клонированием) и выделением рекомбинантных плазмид, содержащих последовательности ДНК или фрагментов генов возбудителей, которые диагносцируются в данной лаборатории.

18). Персонал, работающий в ПЦР-диагностической лаборатории должен пройти соответствующее обучение.

4. Требования к проведению ПЦР-анализа

4.1. Обработка клинических образцов.

1). Забор клинических образцов необходимо производить только в одноразовые пластиковые пробирки или в стеклянные пробирки, предварительно обработанные в течение 1 часа хромовой смесью, тщательно промытые дистиллированной водой и прокаленные.

2). Работать только в одноразовых перчатках.

3) необходимо использовать одноразовые наконечники для автоматических пипеток с аэрозольным барьером.

4). Обязательно менять наконечники при переходе от одной пробы к другой.

5). Использованные пробирки и наконечники должны сбрасываться в одноразовые контейнеры или в специальную емкость с 1Н. раствором соляной кислоты.

4.2. Постановка ПЦР.

1). Работать только в одноразовых перчатках.

2). Следует готовить смесь реактивов для ПЦР, расчитанную на все пробы, включая контрольные, и затем - раскапывать ее по пробиркам.

3). Использовать автоматические пипетки с переменным объемом и оноразовые наконечники.

4). В каждый момент работать только с одной пробиркой.

5) Во всех случаях постановки ПЦР следует обязательно применять отрицательные и положительные контроли в соответствии с инструкцией по применению диагностических наборов.

6). Подготовленные к ПЦР исследуемые образцы должны добавляться в реакционные смеси одноразовыми наконечниками с аэрозольным барьером в последнюю очередь. Использованные наконечники следует сбрасывать в емкость с 1Н. раствором HCl.

4.3. Детекция продуктов амплификации.

1). Анализ продуктов ПЦР должен производиться в изолированной комнате сотрудником лаборатории, не производящим обработки клинических образцов и операций с реакционной смесью.

2). Работать следует только в одноразовых перчатках.

3). Оборудование, реактивы, халаты, перчатки, а также уборочный инвентарь, используемые в комнате детекции продуктов амплификации (пост-ПЦР-помещение), должны храниться только в этой комнате и не должны попадать в пре-ПЦР-помещения.

4). В комнате детекции продуктов амплификации необходимо работать в сменной обуви.

5. Использование физических и химических методов борьбы с контаминацией

1). Рабочие поверхности, оборудование и материалы следует облучать ультрафиолетом с максимумом излучения в области 260 нм. Облучение необходимо проводить в течение 1 часа до начала работы и в течение 1 часа после окончания работы.

2). Использованные наконечники для автоматических пипеток, пробирки и другие загрязненные ДНК материалы необходимо обрабатывать реагентами, вызывающими деградацию ДНК (1 Н HCl, 10% гипохлоритом натрия или 10% хлорной известью).

6. Оценка качества работы ПЦР-диагностической лаборатории

1). Для оценки качества работы ПЦР-диагностической лаборатории следует периодически применять зашифрованные внутрилабораторные контрольные положительные и отрицательные образцы, охарактеризованные не только с помощью полимеразной цепной реакции, но и другими методами диагностики данной инфекции.

2). Следует периодически проводить оценку чувствительности диагностических наборов на основе полимеразной цепной реакции.

 

ЛИТЕРАТУРА

 

ОСНОВНАЯ:

В.Г. Галактионов «Иммунология», 1998 г

Р.В. Петров. – Иммунология, учебник для медвузов. - Медицина 1987 г.

В.И. Пыцкий, Н.В. Андрианова. - Аллергические заболевания. - М., Ме-

дицина, 1990 г.

А. Ройт. - Основы иммунологии.- М. - 1991 г.

В.С. Федосеева с соавт. - Руководство по иммунологическим и аллерго-

логическим методам в гигиенических исследованиях. - М., 1993 г.

А.А. Ярилин. - Основы иммунологии, учебник для студентов медвузов, 1999 г.;

 

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ:

 

1. В.Г. Галактионов. - Графические модели в иммунологии. Медицина 2001 г.

2. В.Г. Галактионов. - Иммунология, 1998 г.

3. Г. Н. Дранник. - Иммунотропные препараты. Киев, 1994 г.

4. Иммунология (под. ред. Пола У.). - т.1,2,3, Мир 1987 г.

5. Л. Йегер Клиническая иммунология и аллергология. - т 1,2,3. Медицина.- 1990 г.

6. С.А. Кетлинский. - Эндогенные иммуномодуляторы, 1992 г.

7. Клиническая ревматология (под ред. КАРРЕЯ). - М, 1990 г.

8. Клиническая иммунология и аллергология (под ред. Г. Лолора, Т. Фишера). – М.,

2000 г.

9. Л.В. Ковальчук, Л.В. Ганковская и др. «Система цитокинов», пособие для студентов, М., 1999 г.

 

10. А.С. Логинов. - Иммунная система и болезни органов пищеварения.

Медицина 1985 г.

11. М.С. Ломакин. - Иммунобиологический надзор. М, 1990 г.

12. Д.Н. Маянский. - Хроническое воспаление. М. 1991 г.

13. Д.К. Новиков «Медицинская иммунология», 1998 г.

14. Д.К. Новиков «Оценка иммунного статуса», 1998 г.