ЛИМФОЦИТОВ
Пролиферативную активность Т-лимфоцитов оценивают по интенсивности синтеза ДНК в ответ на стимуляцию митогеном (поликлональная стимуляция) или антигеном (моно- и олигоклональная стимуляция). В последнем случае применяются распространенные антигены или аллоантигены. Митогены стимулируют пролиферацию значительной части Т-лимфоцитов, поэтому результат оценивают обычно через 3 суток. Антиген стимулирует пролиферацию только тех Т-лимфоцитов, которые несут рецептор к нему, поэтому индуцированную антигеном пролиферацию оценивают через 5—7 суток. Для оценки пролиферативной активности Т-лимфоцитов применяют набор широко распространенных антигенов.
В асептических условиях из вены берется 5 – 10 мл крови в пробирку, содержащую 100 – 200 ЕД гепарина. Содержимое пробирки осторожно перемешивают и оставляют на 60 мин. в термостате при t 37°С для осаждения эритроцитов, которое м.б. ускорено добавлением декстрана, желатина и др. После инкубации в термостате надосадочный слой плазмы, обогащенный лейкоцитами, отсасывают в отдельную стерильную пробирку. Определяют число лейкоцитов в 1 мл. Затем взвесь лейкоцитов разводят питательной средой 199 (содержащей 200 ЕД пенициллина и 100 ЕД стрептомицина в 1 мл) таким образом, чтобы в 1 mi содержалось 1 000000 - 2 000000 лейкоцитов, 20% аутологичной плазмы и 80% культуральной среды.
Приготовленную лейкоцитарную взвесь разливают в стерильные флаконы по 1 мл, добавляют 0,1 мл предварительно оттитрованного антигена и пропускают газовую смесь, содержащую 5% углекислого газа. Флаконы закрывают пробками и помещают в термостат при t 37°С на 5 – 7 дней. За это время культура лейкоцитов периферической крови освобождается от сегментоядерных лейкоцитов, исключая эозинофилы, и содержит преимущественно одноядерные клетки, которые идентифицируются как малые, средние и большие лимфоциты, бласты, ретикулярные клетки и макрофаги.
Интенсивность РБТЛ оценивается различными методами.
Морфологический метод заключается в подсчете в окрашенном мазке активированных кпеток-бластов на 1000 клеток и определении их процентного содержания. Реакция расценивается как положительная, если число активированных клеток составляет не менее 4% от общего числа культивируемых клеток; максимальное число активированных клеток при действии специфического антигена может достигать 35%.
Изотопный метод позволяет определить общую активность культур лимфоцитов путем подсчета включенного в клетки, синтезирующие ДНК, меченного 3Н -тимидина, добавляемого в культуральную среду. Результаты обычно выражают в импульсах в минуту (имп/мин) и в виде индекса стимуляции — отношение радиоактивности стимулированных и нестимулированных лимфоцитов.
Достоверность РБТЛ проверяется контрольными исследованиями с культурой исследуемых лимфоцитов без добавления антигена (для выявления спонтанной бласттрансформации) и с культурой лимфоцитов здоровых доноров, инкубируемой с соответствующим антигеном.
ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ СИСТЕМЫ
ФАГОЦИТИРУЮЩИХ КЛЕТОК. ФАГОЦИТАРНАЯ АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛОВ
Важнейшей характеристикой функции гранулоцитов является оценка их фагоцитарной активности. Ее снижение может быть результатом как недостаточности опсонирующих факторов сыворотки (антител, комплемента), так и дефектов самих клеток (нарушения двигательной и метаболической активности врожденного или приобретенного характера). Для определения фагоцитарной активности используют стандартные штаммы непатогенных микроорганизмов (например, стафилококки штамма 209, убитые бактериями, аутофлора больного и др.).
Методика определения фагоцитарной активности
Нейтрофилов.
Необходимые материалы и реактивы: микропипетки или пипетки для взятия крови на СОЭ; пробирки стеклянные (лучше силиконизированные) или из пластика; предметные стекла; микроскоп с иммерсией; термостат; свежеприготовленный раствор 5% цитрата натрия; живая суточная культура микроорганизмов, например стафилококк штамм 209; оптический стандарт мутности с образцами в 5, 10, и 20 ед., соответствующими 0,5 -, 1- и 2-миллиардной взвеси микроорганизмов.
В пробирку, содержащую 0,1 мл 5% раствора цитрата натрия, вливают 0,2 мл капиллярной крови и добавляют 0,1 мл 2-миллиардной взвеси микроорганизмов. Инкубируют 30 мин при 37°С. Из взвеси клеток и микроорганизмов делают мазки, оставшуюся взвесь продолжают инкубировать еще в течение 1 ч и снова делают мазки. Мазки фиксируют смесью Никифорова и окрашивают по Романовскому-Гимзе. Под микроскопом просматривают 100 нейтрофилов, определяют количество поглощенных микробов.
Оценка фагоцитоза in vitro производится в соответствии фазами реакции: через 30 мин и 2 часа. Поглотительная способность клеток оценивается по двум показателям: процент фагоцитоза, количество фагоцитов на 100 нейтрофилов через 30 мин и 2 часа инкубации (в процентах), ФИ – среднее число микробов на 1 фагоцит через 30 мин и 2 часа инкубации. О последней фазе фагоцитоза – переваривании – судят по коэффициентам процента фагоцитоза и ФИ (отношение соответствующих показателей, изученных через 2 часа контакта, к тем же показателям через 30 мин). Фагоцитоз считается завершенным при коэффициентах менее 1.
НСТ- ТЕСТ
Тест с нитросиним тетразолием (НСТ-тест) используется для выявления так называемых активированных гранулоцитов и моноцитов. В основе активации фагоцитов лежит резкое усиление окислительных реакций. К числу индикаторов этого явления относится реакция с нитросиним тетразолием: поглощенный из раствора, он под влиянием окислительных процессов в клетке превращается в нерастворимый формазан. Последний определяется в клетке в виде темно-синих гранул.
Различают спонтанный и стимулированный НСТ-тест. Результаты спонтанного теста указывают на количество активированных клеток в крови больного, например под влиянием инфекции. Результаты стимулированного теста дают представление о способности исследуемых нейтрофилов к активации in vitro. Этот тест следует проводить при сниженном числе спонтанных НСТ-положительных клеток у больного с бактериальной инфекцией, чтобы выявить наличие или отсутствие дефекта окислительного метаболизма.
Методика исследования.
Необходимые реактивы и материалы: КН 42 0PO 44 0, Na 42 0РО 44 0, NaCI, глюкоза, нитросиний тетразолий, гепарин, метиловый спирт, 1% водный раствор метиленового зеленого (в случае загрязнения синей краски необходимо промывание хлороформом через делительную воронку), микропипетки, предметные стекла, микроскоп с иммерсией.
Приготовление раствора:
А. 1% 15 М фосфатного буфера с рН 7,2 с добавлением 0,2% раствора глюкозы и 0,6% раствора натрия хлорида (к 25 мл 1/15 М КН 42 0РО 44 0 добавляют 36 мл 1/15 М раствора Na 42 0НРО 44 0; на 61 4 0 мл буфера нужно 120 мг глюкозы и 370 4 0мг NaCI).
Б. 0,1% нитросиний тетразолий в изотоническом растворе натрия хлорида. Для получения красителя необходимы длительное перемешивание и подогревание в горячей воде.
Растворы А и Б фильтруют через бумажные фильтры и хранят в холодильнике при температуре 10°С в течение 2 – 4 недель. Непосредственно перед постановкой теста смешивают равные количества растворов А и Б, смесь нагревают до 30 - 37°С. Кровь из пальца больного берут пипеткой, промытой гепарином. В центрифужной или пластиковой пробирке смешивают по 0,1 мл гепаринизированной крови и подогретой смеси. Инкубация 25 мин в термостате при 37°С, затем 10 мин при комнатной температуре. Из верхнего слоя клеточного осадка готовят мазки, высушивают их на воздухе 3 – 5 мин, фиксируют метиловым спиртом, затем окрашивают метиленовым зеленым в течение 10 мин. Препараты просматривают под микроскопом с иммерсией.
Постановка стимулированного НСТ-теста. Гепаринизированную кровь предварительно инкубируют 25 мин при 37°С со стимулятором (например, 2-миллиардной взвесью стафилококка - штамм 209, надосадочной жидкостью, содержащей лимфокины и др.) в равных объемах. Затем проводят вышеописанный тест.
Учет результатов: В клинико-лабораторной практике при постановке теста восстановления нитросинего тетразолия наиболее широкое распространение получил цитохимический учет результатов, основанный на микроскопическом определении процентного содержания нейтрофилов с гранулами темно-синего цвета формазана в цитоплазме. Обычно анализу подвергают 100 – 200 сегментоядерных нейтрофилов. Показатель индуцированного варианта реакции вычисляют как разницу процентного содержания поглотивших и восстановивших тетразолий клеток после воздействия фактора стимуляции по сравнению с данными, полученными до стимуляции.
Для количественной оценки активности теста по степени активности реакции все клетки делят на 4 группы. К нулевой группе относят нейтрофилы без гранул, в первую группу включают клетки с единичными гранулами или те клетки, в которых площадь окраски формазаном занимает до 25 – 30% цитоплазмы (1 степень активности), во вторую группу нейтрофилы, цитоплазма которых на 30 – 70% занята гранулами формазана (II степень активности); в третью - нейтрофилы, до 100% заполненные гранулами независимо от того, контролировались ядра или нет (III степень активности). Определяют число клеток, принадлежащих в зависимости от активности фермента к каждому из типов. Это число умножают на номер (фактор) типа. Сумма полученных произведений представляет показатель реакции. Таким образом, показатель реакции восстановления нитросинего тетразолия можно рассчитать по формуле:
Показатель НСТ-теста = 1а + 2б + Зс,
где а, б, с - количество клеток соответственно нулевого, 1, 2, 3 типов.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
образом Принцип метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Polymerase chain reaction, PCR) был разработан сотрудником фирмы "Cetus"(США) Кэри Мюллисом в 1983 г., и в настоящее время широко используется как для научных иследований, так и для диагностики в практическом здравохранении и службе санэпиднадзора (генотипирование, диагностика инфекционных заболеваний).
Основы метода ПЦР
В основе метода ПЦР лежит природный процесс - комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы. Эта реакция носит название репликации ДНК.
Естественная репликация ДНК включает в себя несколько стадий:
1) Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали, расхождение нитей ДНК);
2) Образование коротких двухцепочечных участков ДНК (затравок, необходимых для инициации синтеза ДНК);
3) Синтез новой цепи ДНК (комплементарное достраивание обеих нитей)
Данный процесс можно использовать для получения копий коротких участков ДНК, специфичных для конкретных микроорганизмов, т.е. осуществлять целенаправленный поиск таких специфических участков, что и является целью генодиагностики для выявления возбудителей инфекционных заболеваний.
Открытие термостабильной ДНК-полимеразы (Taq-полимеразы) из термофильных бактерий Thermis aquaticus, оптимум работы которой находится в области 70-72оС, позволило сделать процесс репликации ДНК циклическим и использовать его для работы in vitro. Создание программируемых термостатов (амплификаторов), которые по заданной программе осуществляют циклическую смену температур, создало предпосылки для широкого внедрения метода ПЦР в практику лабораторной клинической диагностики. При многократном повторении циклов синтеза происходит экспоненциальное увеличение числа копий специфического фрагмента ДНК, что позволяет из небольшого количества анализируемого материала, который может содержать единичные клетки микроорганизмов получить достаточное количество ДНК копий для идентификации их методом электрофореза.
Комплементарное достраивание цепи начинается не в любой точке последовательности ДНК, а только в определеннных стартовых блоках- коротких двунитевых участках. При присоединении таких блоков к специфическим участкам ДНК можно направить процесс синтеза новой цепи только в этом участке, а не по всей длине ДНК цепи. Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют две олигонуклеотидные затравки (20 нуклеотидных пар), называемые праймерами. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними.
Таким, ПЦР представляет собой многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка ДНК катализируемое ферментом ДНК- полимеразой.
Для проведения амплификации необходимы следующие компоненты:
ДНК-матрица (ДНК или ее часть, содержащая искомый специфический фрагмент); Праймеры (синтетические олигонкулеотиды (20-30 нуклеотидных пар), комплементарные последовательностям ДНК на границах определяемого специфического фрагмента). Выбор специфического фрагмента и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации, что сказывается на качестве проведения анализа. Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) (смесь четырех дНТФ, являющихся материалом для синтеза новых комплементарных цепей ДНК) Фермент Taq-полимераза (термостабильная ДНК-полимераза, катализирующая удлиннение цепей праймеров путем последовательного присоединения нуклеотидных оснований к растущей цепи синтезируемой ДНК) Буферный раствор (реакционная среда, содержащая ионы Mg2+, необходимые для поддержания активности фермента)
 |
Рис. 25. Схема ПЦР
Для определения специфических участков генома РНК-содержащих вирусов, сначала получают ДНК-копию с РНК-матрицы, используя реакцию обратной транскрипции (RT), катализируемую ферментом ревертазой (обратной транскриптазой).
Для получения достаточного количества копий искомого характеристического фрагмента ДНК амплификация включает несколько (20-40) циклов.
Каждый цикл амплификации включает 3 этапа, протекающих в различных температурных режимах
1 этап: Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали). Протекает при 93-95ов течение 30-40 сек.
2 этап: Присоединение праймеров (отжиг). Присоединение праймеров происходит комплементарно к соответствующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах специфического участка. Для каждой пары праймеров существет своя температура отжига, значения которой располагаются в интервале 50-65оС. Время отжига -20-60 сек.
3 этап: Достраивание цепей ДНК. Комплементарное достраивание цепей ДНК происходит от 5’-конца к 3’-концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (дНТФ). Процесс синтеза катализируется ферментом термостабильной ДНК-полимеразой (Taq-полимеразой) и проходит при температуре 70-72оС. Время протекания синтеза - 20-40 сек.
 |
Рис. 26. Схема ПЦР (продолжение).
Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для второго цикла амплификации, в котором происходит образование искомого специфического фрагмента ДНК (ампликона). В последующих циклах амплификации ампликоны служат матрицей для синтеза новых цепей. Таким образом происходит накопление ампликонов в растворе по формуле 2n, где n-число циклов амлификации. Поэтому, даже если в исходном растворе первоначально находилась только одна двухцепочечная молекула ДНК, то за 30-40 циклов в растворе накапливается около 108 молекул ампликона. Этого количества достаточно для достоверной визуальной детекции этого фрагмента методом электрофореза в агарозном геле. Процесс амплификации проводится в специальном программируемом термостате (амплификаторе), который по заданной программе автоматически осуществляет смену температур согласно числу циклов амплификации.
 |
Метод ПЦР в лабораторной диагностике
В основе метода ПЦР, как инструмента лабораторной диагностики инфекционных заболеваний лежит обнаружение небольшого фрагмента ДНК возбудителя (несколько сот пар оснований), специфичного только для данного микроорганизма, с использованием полимеразной цепной реакции для накопления искомого фрагмента. Методика проведения анализа с использованием метода ПЦР включает три этапа:
Рис. 27. Схема ПЦР (продолжение).
· 1. Выделение ДНК (РНК) из клинического образца
· 2. Амплификация специфических фрагментов ДНК
· 3. Детекция продуктов амплификации
Выделение ДНК (РНК)
На данной стадии проведения анализа клиническая проба подвергается специальной обработке, в результате которой происходит лизис клеточного материала, удаление белковых и полисахаридных фракций, и получение раствора ДНК или РНК, свободной от ингибиторов и готовой для дальнейшей амплификации.
Выбор методики выделения ДНК(РНК) в основном определяется характером обрабатываемого клинического материала.
Амплификация специфических фрагментов ДНК На данной стадии происходит накопление коротких специфических фрагментов ДНК в количестве, необходимом для их дальнейшей детекции. В большинстве методик определения специфических фрагментов генома используется т.н. “классический вариант направленной ПЦР. Для повышения специфичности и чувствительности анализа в некоторых методиках используется метод “гнездной” (nested) ПЦР, в котором используются 2 пары праймеров (“внешние” - для 1 стадии, и “внутренние” - для 2-ой стадии).
Детекция продуктов амплификации В большинстве методик на данном этапе проводится разделение смеси продуктов амплификации, полученной на 2-ой стадии, методом горизонтального электрофореза в агарозном геле. До проведения электрофоретического разделения, к амплификационной смеси добавляется раствор бромистого этидия, образущий с двухцепочечными фрагментами ДНК прочные соединения внедрения. Эти соединения под действием УФ-облучения способны флуоресцировать, что регистрируется в виде оранжево-красных светящихся полос после электрофоретического разделения амплификационной смеси в агарозном геле. В качестве альтернативы электрофоретическому методу детекции, имеющему некоторые недостатки: субъективность чтения результатов, ограничения по определению ДНК различных микроорганизмов в одной реакции, могут быть предложены гибридизационные схемы детекции. В этих схемах образующийся в результате амплификации фрагмент ДНК гибридизуется (образует 2-х цепочечные комплексы - "гибриды") со специфическим олигонуклеотидным зондом.
Преимущества метода ПЦР
Преимущества метода ПЦР как метода диагностики инфекционных заболеваний
· Прямое определение наличия возбудителей Многие традиционные методы диагностики, например иммуноферментный анализ, выявляют белки-маркеры, являющиеся прдуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что дает лишь опосредованное свидетельство наличия инфекции. Выявление специфического участка ДНК возбудителя методом ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции.
· Высокая специфичность Высокая специфичность метода ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что исключает возможность получения ложных результатов, в отличие от метода иммуноферментного анализа, где нередки ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антигенами.
· Высокая чувствительность Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно. Чувствительность ПЦР-анализа составляет 10-1000 клеток в пробе (чувствительность иммунологических и микроскопических тестов - 103-105 клеток).
· Универсальность процедуры выявления различных возбудителей Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК возбудителя. Метод основан на выявлении фрагмента ДНК или РНК, являющегося специфичным для конкретного организма. Сходство химического состава всех нуклеиновых кислот позволяет применять унифицированные методы проведения лабораторных исследований. Это дает возможность диагносцировать несколько возбудителей из одной биопробы. В качестве исследуемого материала могут использоваться различные биологические выделения (слизь, моча, мокрота), соскобы эпителиальных клеток, кровь, сыворотка.
· Высокая скорость получения результата анализа Для проведения ПЦР-анализа не требуется выделение и выращивание культуры возбудителя, что занимает большое количество времени. Унифицированный метод обработки биоматериала и детекции продуктов реакции, и автоматизация процесса амплификации дают возможность провести полный анализ за 4-4.5 часа.
· Возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях. Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов.
Следует отметить, что методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва и т.д.)
Применение метода ПЦР в практическом здравохранении
Использование метода ПЦР для диагностики инфекционных заболевании как бактериальной, так и вирусной природы имеет колоссальное значение для решения многих проблем микробиологии и эпидемиологии.
Применение этого метода также способствует развитию фундаментальных исследований в области изучения хронических и малоизученных инфекционных заболеваний.
Однако следует отметить, что метод ПЦР лишь дополняет спектр традиционных методов, используемых в микробиологической диагностике.
Наиболее рационально и эффективно применение ПЦР для обнаружения микроорганизмов трудно культивируемых в лабораторных условиях, атипичных форм бактерий. К ним также относятся внутриклеточные паразиты и микроорганизмы, способные длительно персистировать в организме хозяина. Высокоспецифичная, чувствительная и быстрая диагностика многих тяжелых заболеваний способствует не только их эффективному лечению, но и предотвращению распространения инфекции.
Наиболее эффективно и экономически обоснованно использование метода в урогинекологической практике - для выявления хламидиоза, уреаплазмоза, гонореи, герпеса, гарднереллеза, микоплазменной инфекции; в пульмонологии - для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулеза; в гастроэнтерологии - для выявления геликобактериоза; в клинике инфекционных заболеваний - в качестве экспресс-метода диагностики сальмонеллеза, дифтерии, вирусных гепатитов В,С и G; В гематологии - для выявления цитомегаловирусной инфекции, онковирусов.
 |
Некоторые аспекты применения ПЦР в различных областях медицинской практики рассматриваются в предлагаемых пособиях для врачей (см. Методические рекомендации)
Рис.28. М: маркеры; 1: ПЦР-продукт, полученный с использованием dNTPs производства "Лаборатории Медиген"; 2-3: ПЦР-продукт, полученный с использованием dNTPs других коммерческих источников.
