С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ
АНТИТЕЛ НА ПРЕПАРАТАХ ЛИМФОЦИТОВ ТИПА
"ВЫСУШЕННОЙ КАПЛИ"
1) В градиенте фиколл-верографин выделить 0,5 млн. лейкоцитов нанести каплю (20 мкл.) на предметное стекло, осторожно поместить его на 20 мин. в бытовой холодильник при +4°С.
ВНИМАНИЕ: Стекло должно быть идеально чистым, обезжиренным и сухим. На жирных стеклах капля растекается.
2) По завершении 20 мин. остатки жидкости испарить под вентилятором при комнатной температуре, поместить на гистологический планшет, закрыть и хранить до 3-х дней при +4°С, дольше - при минус 20°С, или сразу же проводить иммуно-гистохимическую реакцию. Если стекла хранились в холодильнике, их следует довести до комнатной температуры 20 - 30 мин.
3) Зафиксировать каплю в течение 10 мин. в парах 10%-го нейтрального формалина.
4) Промыть каплю 5раз по 100мкл. аптечного физиологического раствора, стряхнуть, «отсосать»капельки фильтровальной полоской. Следить за клетками,их можно нечаянно «отсосать».
5) Нанести 20 мклхорошо перемешанного раствора моноклонального антитела, инкубировать 1 часпри комнатной температуре под чашкойПетри, на влажной бумаге или салфетке.
6) Промыть по п. 4.
7) Нанести 20 мл. хорошо перемешанного пероксидазного конъюгата. Инкубировать по п. 5.
8) Минут за 10 до окончания инкубации (п. 7) начать готовить раствор хромогена. Ампулу с навеской (5 мг) DAB прилить 1 мл, трисбуфера (рН=7,2 – 7,4) перемешать хромогендо полногорастворения и перелить в стеклянный флакон с 4-мя мг трисбуфера, очень хорошо перемешать, добавить 50 мкл. аптечной 3%-ой перекиси водорода. Если субстрат быстро чернеет проверьте исходную концентрацию аптечной перекиси: она может быть выше, чем 3%!
9) Промыть по п.4.
10) Нанести 50 мкл. раствора хромогена и инкубировать от 1 до 10 мин. под визуальным контролем до появления окрашивания.
11) Отмыть по п. 5, слегка докрасить ядра метиловые зеленым, если необходимо. Отсосать жидкость, внести 20 мкл. 50% глицерина и учитывать реакцию (считать число желтовато-бурых клеток в попе зрения), опустив объектив микроскопа Х 90 в глицерин. Очень осторожно, если нет покровного стекла.
Табл. 8. Основные маркеры клеток иммунной системы
| Антиген | Популяция | % клеток |
| CD2 | Т- и NK-клетки | 80 ± 7 |
| CD3 | Т-клетки | 72 ± 7 |
| CD4 | Т-хелперы | 39 ± 5 |
| CD5 | зрелые Т-клетки, В-ХЛЛ | 69 ± 5 |
| CD7 | Т- и NК-клетки | 75 ± 7 |
| CD8 | Т- киллеры / супрессоры | 23 ± 4 |
| CD1O | пре-В-лифоциты | |
| CD11b | Т-супрессоры | 21 ± 6 |
| CD14 | моноциты | 100% моноцитов |
| CD16 | NK- клетки | 12 ± 6 |
| CD19 | В-клетки | 9 ± 6 |
| CD20 | В-клетки | 9 ± 6 |
| CD2J | В-клетки | 9 ± 6 |
| CD22 | В-клетки | 9 ± 6 |
| CD23 | акт. В-клетки | 3 ± 3 |
| CD27 | 90% CD4+ и 77% CD8+ клеток | 65 ± 10 |
| CD29 | часть CD4+ и CD8+ клеток | 54 ± 11 |
| CD38 | В-клетки, акт. лимфоциты | 23 ± 6 |
| CD45 | все лейкоциты | |
| CD45RA | 50% CD4+ клеток и 75% CD8+ клеток, NK- и В-клетки | 64+10 |
| CD50 | ICAM-3, все лейкоциты | |
| CD54 | ICAM-1 | 22 ± 8 |
| CD58 | все лейкоциты | |
| CD59 | все лейкоциты | |
| CD71 | акт. лимфоциты | |
| CD72 | В-клетки | 9 ± 6 |
| CD75 | В-клетки | 9 ± 6 |
| CD95 | Активированные лимфоциты | |
| I CD98 | Активированные лимфоциты | |
| HLA-DR | моноциты. В—клетки и активированные Т-клетки | 14 ± 7 |
Качественные и количественные методы определения иммуноглобулинов.
Методы исследования иммуноглобулинов включают в себя определение уровня иммуноглобулинов разных классов и подклассов и антител к определенным антигенам. При оценке результатов исследования необходимо учитывать, что уровень иммуноглобулинов зависит от возраста. Изменение уровня иммуноглобулинов в сыворотке может быть следствием нарушения их синтеза, катаболизма или выведения.
Электрофорез
1. Зональный электрофорез — полуколичественный метод, позволяющий разделить смесь белков в зависимости от их молекулярной массы и электрического заряда. Суть метода заключается в следующем: исследуемую смесь белков на носителе (например, пластине с гелем) помещают в камеру для электрофореза, заполненную буферным раствором и подключенную к источнику постоянного тока. При электрофорезе белков сыворотки обычно получается 5 основных полос, которые соответствуют фракциям альбумина, а, а2, β- и γ -глобулинов (рис. 19). Иммуноглобулины мигрируют преимущественно во фракцию γ-глобулинов. Относительное содержание каждой фракции сывороточных белков можно оценить с помощью денситометра. С помощью зонального электрофореза можно исследовать не только сыворотку, но и другие биологические жидкости, например спино-мозговую жидкость и мочу. Этот метод позволяет оценить белковый состав исследуемой пробы и выявить моноклональные антитела.
Рис. 19. Зональный электрофорез нормальной сыворотки. На электрофореграмме и денситограмме нормальной сыворотки видны пять основных полос, которые соответствуют альбумину, а, а2, β- и γ - глобулинам
2. Иммуноэлектрофорез. Суть метода заключается в следующем: I) проводят электрофоретическое разделение белков в геле; 2) по окончании электрофореза в геле параллельно направлению электрофореза вырезают бороздки; 3) в бороздки вносят антитела (антисыворотку), например к тяжелым или легким цепям иммуноглобулинов. Эти антитела и разделенные при электрофорезе белки диффундируют навстречу друг другу. В тех местах, где антитела связываются с белками, образуются дуги преципитации. Иммуноэлектрофорез позволяет оценить лишь качественный состав исследуемой смеси белков. Оценка результатов исследования требует высокой квалификации. Чаще всего этот метод применяется для выявления и характеристики моноклональных антител.
3. Электрофорез с иммунофиксацией. Этот метод основан на электрофоретическом разделении белков сыворотки в геле с последующей инкубацией геля в присутствии антител к тяжелым и легким цепям иммуноглобулинов. При связывании белков с антителами образуются иммунные комплексы, которые можно увидеть после окрашивания. Иммунные комплексы, содержащие нормальные иммуноглобулины откладываются в виде широкой, размытой полосы, моноклональные — в виде более узкой и четко очерченной. Этот метод также является качественным, однако более чувствителен и прост, чем иммуноэлектрофорез. Электрофорез с иммунофиксацией часто применяется в сочетании с иммуноэлектрофорезом для определения моноклональных или олигоклональных иммуноглобулинов.
|
Рис. 20. Иммуноэлектрофорез сыворотки здорового (3) и больного с моноклональной гаммапатией (Б), сопровождающейся повышением уровня γ - и к- цепей. Антитела к γ - и к-цепям образуют более широкие дуги преципитации с сывороткой больного, чем с сывороткой здорового (Г. Лолор, Т. Фишер, 2000).
 |
Рис. 21. Электрофорез с иммунофиксацией (нормальная сыворотка). На полосках геля видны размытые полосы преципитации, соответствующие тяжелым (γ, a и m) и легким (к и l) цепям иммуноглобулинов. Тяжелые и легкие цепи моноклональных иммуноглобулинов откладываются в виде более узких и четко очерченных полос (на рисунке не показано). Контроль — электрофорез нормальной сыворотки без иммунофиксации (Г. Лолор, Т. Фишер, 2000).
Б. Двойная радиальная иммунодиффузия — полуколичественный метод, с помощью которого можно не только выявить антигены, но и оценить степень сходства между ними. Суть метода заключается в следующем: 1) в лунки, вырезанные в агаре, вносят исследуемую смесь антигенов и антитела с известной специфичностью (обычно в центральную лунку вносят антитела, а в расположенные вокруг нее — антигены); 2) антигены и антитела диффундируют по направлению друг к другу; 3) в том месте, где произошло связывание антител и антигенов, образуются полосы преципитации. По взаимному расположению и форме полос преципитации можно оценить степень сходства между антигенами, находящимися в соседних лунках. В настоящее время этот метод применяется в диагностике аутоиммунных заболеваний для выявления аутоантител к экстрагируемым ядерным антигенам. Хотя по чувствительности метод двойной радиальной иммунодиффузии уступает многим количественным методам, технически он прост, не требует высокоочищенных антител, специфичен и может использоваться при проведении массовых исследований.
В. Простая радиальная иммунодиффузия позволяет количественно определить содержание антигена в исследуемой пробе. Суть метода заключается в следующем. В слое агара, содержащего антитела, вырезают лунки, в одни из которых вносят исследуемый антиген, в другие — стандартный. Антигены диффундируют из лунок в агар, образуя радиальные зоны преципитации. Диаметр зоны преципитации пропорционален концентрации антигена. Это простой и надежный метод количественной оценки иммуноглобулинов (включая подклассы IgG), компонентов комплемента (например, СЗ, С4, фактора В) и других белков сыворотки. Существуют готовые наборы, позволяющие определить антиген в низкой концентрации — не более 3 мкг/мл. Определяя содержание иммуноглобулинов, необходимо учитывать, что изменение их свойств может искажать результаты исследования. Так, если в сыворотке содержатся мономерные IgM (например, при макроглобулинемии Вальденстрема, атаксии-телеангиэктазии), уровень IgM будет искусственно завышен, поскольку мономерный IgM диффундирует быстрее, чем пентамерный. Присутствие ревматоидного фактора в исследуемой пробе, напротив, искусственно снижает уровень IgG, поскольку иммунные комплексы, состоящие из IgG и ревматоидного фактора, диффундируют медленнее, чем несвязанный IgG. Сыворотка многих больных с дефицитом IgA содержит антитела к белкам животного происхождения, например к козьим иммуноглобулинам, поэтому при использовании козьих антител для определения уровня IgA в этом случае получаются завышенные результаты.
Техника реакции: Разведение (титр) моноспецифической антисыворотки. которое обеспечивает четкое кольцо преципитации со стандартной сывороткой, указывается предприятием-изготовителем. При этом разведение моноспецифических сывороток подбирают таким образом, чтобы с цельной стандартной англобулиновой сывороткой формировалось кольцо: диаметром 11 – 12 мм с анти-lgA-сывороткой 8 – 9 мм и анти-lgM-сывороткой – 6 – 7 мм. В каждой серии опытов стандартную моноспецифическую сыворотку с известным содержанием иммуноглобупинов испытывают в разведениях 1:2, 1:4, 1:8, цельная. Приготовленный 2% агар на буфере перед опытом растапливают на кипящей бане, затем помещают в термостат при 48°С. Количество агара, необходимое для одного стекла рассчитывают таким образом, чтобы толщина застывшего слоя была 1 – 2 мм. Моноспецифические сыворотки разводят тем же буферным раствором из расчета вдвое меньше указанных титров и нагревают на водяной бане до 50°С, После этого разведения антисыворотки тщательно смешивают с агаром в равном объеме. Смесь агара с антисывороткой разливают на предварительно подогретые стекла, лежащие строго горизонтально. После застывания агара в нем металлическим штампом с внутренним диаметром 2 мм выбивают лунки на расстоянии 1 – 1,5 см друг от друга. Четыре первые лунки заполняют сывороткой в различных разведениях (цельная, 1:2, 1:4, 1:8), в остальные вносят испытуемые сыворотки. Во избежание ошибок при учете результатов лунки заполняют очень аккуратно с помощью микрошприца или капилляра. Стекла помещают во влажную камеру при комнатной температуре. Учет результатов проводят через 24 часа для иммуноглобулинов G и А, через 48 часов для IgM.
Учет реакции: По окончании времени реакции измеряют диаметры образовавшихся колец преципитации. На графике по оси ординат откладывают квадраты радиусов колец преципитации, а по оси абсцисс – известное количество иммуно-глобулинов (г/л), содержащихся в эталонной сыворотке соответствующего разведения. Полученные точки соединяют прямой. Содержание иммуноглобулинов в испытуемом образце определяют по построенной прямой, отдельной для каждого класса иммуноглобулинов.
Г. Нефелометрия — определение концентрации взвешенных частиц и высокомолекулярных веществ в растворе, основанное на оценке интенсивности рассеяния света, проходящего через этот раствор. Нефелометрия может быть использована для определения концентрации антигенов, поскольку при добавлении к ним антител образуются иммунные комплексы, рассеивающие проходящий свет. Нефелометрия позволяет с высокой точностью определить концентрацию IgG, IgA, IgM, подклассов IgG, СЗ, С4, фактора В, С-реактивного белка и некоторых других сывороточных белков. Этот метод подходит для определения белков в низкой концентрации, например IgE, уровень которого в сыворотке не превышает 1 мкг/мл. В настоящее время многие лаборатории используют нефелометрию в качестве стандартного метода количественного определения иммуноглобулинов.
Д. Радиоиммунный анализ. Этот высокочувствительный метод разработан более 30 лет назад и сначала использовался для определения концентрации инсулина и других гормонов. Сейчас он используется и для определения антигенов и антител. Существует несколько модификаций метода. Одна из них основана на конкурентном связывании меченного радиоактивным изотопом и немеченого антигена с антителами. Суть метода заключается в следующем: 1) известное количество антител смешивают с известным количеством меченого антигена и исследуемой пробой (содержащей неизвестное количество антигена); 2) антиген, содержащийся в пробе, и стандартный меченый антиген связываются с антителами; 3) чем выше содержание немеченого антигена, тем меньше меченого антигена свяжется с антителами. Концентрацию антигена в исследуемой пробе оценивают по уровню радиоактивности иммунных комплексов. Тот же подход может быть использован для определения концентрации антител в пробе. В этом случае известное количество антигена смешивают с известным количеством стандартных меченых антител и исследуемой пробой (содержащей неизвестное количество антител). Другая модификация метода основана на иммобилизации антигена или антитела на твердой подложке. Основные недостатки метода — необходимость дорогостоящего оборудования и реактивов, а также условий для работы с радиоактивными изотопами.
Е. Твердофазный иммуноферментный анализ. В качестве твердой фазы чаще всего используются полистироловые планшеты с сорбированными на них антигенами или антителами. Определение антител к какому-либо антигену проводят следующим образом: 1) исследуемую жидкость вносят в лунки планшета с сорбированным на них антигеном; 2) во время инкубации антитела связываются с антигеном; 3) планшет отмывают от несвязавшихся антител и добавляют антитела к иммуноглобулинам (вторые антитела), меченные ферментом; 4) планшет вновь отмывают, добавляют субстрат фермента и хромоген (вещество, меняющее окраску в процессе химической реакции); 5) под действием продукта ферментативной реакции хромоген меняет окраску. Чем больше меченных ферментом вторых антител связывается с комплексами антиген—антитело, тем выше активность фермента и интенсивность окраски раствора. Концентрацию антител в пробе определяют спектрофотометрически — по оптической плотности окрашенного раствора. Такой же подход применяется для определения антигена в пробе. В этом случае используются планшеты с сорбированными антителами к исследуемому антигену, меченные ферментом вторые антитела также направлены к этому антигену (рис. 20.5). Твердофазный иммуноферментный анализ применяют для количественной оценки антител и антигенов. По чувствительности он сопоставим с радиоиммунным анализом, но более прост, дешев и не требует применения радиоактивных изотопов. Многие лаборатории используют твердофазный иммуноферментный анализ в качестве стандартного метода определения противовирусных антител, включая антитела к ВИЧ, цитокинов и иммуноглобулинов (IgE и подклассов IgG).
Рис. 22. Твердофазный иммуноферментный анализ. А. Определение антител. Б. Определение антигенов. При радиоиммунном анализе в качестве метки используется радиоактивный изотоп, при иммунофлюоресцентном анализе — флюорохром (Г. Лолор, Т. Фишер, 2000).
