Химическая природа ферментов

 

Ферменты являются белками. Это доказывается тем, что ферменты брожения инактивируются (Jl. Пастер) при кипячении, при котором происходит необратимая денатурация белка-фермента. Фермент при этом теряет свою способность катализировать химическую реакцию. Точно так же при кипячении белки теряют другие биологические свойства – антигенные, гормональные, каталитические. Ферменты при гидролизе распадаются на аминокислоты.

Многие ферменты выделены в виде индивидуального белка в кристаллической форме, сейчас свыше 200 ферментов выделены в чистом виде и изучена их первичная структура. Первый кристаллический фермент уреаза был получен в 1926 году Самнером. В 1930 г. Нортрап выделил в виде кристаллов пепсин, в 1931 г. – трипсин.

Будучи белками, они обладают амфотерными свойствами – могут существовать в растворе в виде анионов, катионов и амфионов, обладают электрофоретической подвижностью, а в изоэлектрической точке не обнаруживают подвижности; неспособны к диализу через полупроницаемые мембраны, легко осаждаются методом высаливания, ацетоном, этанолом, обладают высокой молекулярной массой (см. таблицу 4.1.).

Таблица 4.1.

Молекулярная масса ферментов

Фермент	М.м.	Фермент	М.м.
Рибонуклеаза Цитохром С Трипсин Пепсин Каталаза Глутаматдегидрогеназа		Гексокиназа Щелочная фосфатаза Лактатдегидрогеназа Альдолаза Уреаза Пируватдегидрогеназа	140000 142000 480000 4500000

 

Ферменты обладают высокой специфичностью действия. В последние годы показано, что кроме белков ферментативной активностью обладают и молекулы РНК, их называют рибозимы. Каталитической активностью обладают также некоторые антитела, их называют абзимы. Так антитела, образующиеся при аутоиммунных заболеваниях, способны гидролизовать белки, РНК и ДНК. Иммуноглобулины G молока и их фрагменты могут гидролизовать моно-, ди- и трифосфаты.

При работе с ферментами нужно учитывать их белковую природу, чтобы сохранить их стабильность; для этого надо соблюдать:

1) оптимальную температуру ферментативной реакции - для теплокровных животных 37-40 ⁰C, а при выделении и очистке ферментов - 0 ⁰C. Нужно учесть, что некоторые ферменты очень чувствительны к пониженной температуре (АТФаза из митохондрий);

2) рН - в пределах 6,0-8,0 оптимален для большинства ферментов. Хотя имеются ферменты для которых оптимальными являются рН 2,0 (пепсин) и рН 7-10 (трипсин);

3) лиофильная сушка - высушивание в вакууме из замороженного состояния - широко применяется для получения нативных белковых препаратов и их длительного хранения. Примеры: криоконсервирование крови, антигенов, антител -диагностикумов, вирусных, бактериальных препаратов, получение сухого молока и т.д.;

4) осаждение ацетоном и спиртом проводят при низкой температуре, что позволяет сохранять нативность ферментов;

5) для стабилизации ферментов используются часто хелатообразующим веществом ЭДТА - этилендиаминтетраацетатом, который связывает ионы тяжелых металлов (Cu, Pb, Hg и т.д.), тем самым способствует сохранению нативных свойств фермента.

 

Строение ферментов

Ферменты относятся к простыме и сложныме белкам. Ферменты однокомпонентные – простые белки. К ним относятся гидролитические ферменты – пепсин, трипсин, папаин,уреаза, лизоцим, рибонуклеаза, фосфатаза и др.

Ферменты двухкомпонентные (сложные белки) – кроме белкового компонента, содержат небелковый компонент – кофермент, белковая часть называется апоферментом, а все вместе называется холоферментом.

Кофермент может быть связан с белковой частью ковалентной связью, но могут быть и слабые связи – водородные, электростатические взаимодействия и др.

В случаях слабой связи между коферментом и белковой частью при выделении может происходить диссоциация – отделение небелковой части и изолированный белковый компонент оказывается лишенной ферментативной активности. Такими коферментами являются витамины B₁ – тиамин, B₂ – рибофлавин, B₆ – пиридоксол, PP – никотинамид и другие. Ферменты, содержащие их, при выделении, очистке, как правило, теряют активность и лишь при добавлении кофактора вновь приобретают активность. Многие двухвалентные металлы (Mg²⁺, Mn²⁺, Ca²⁺) выполняют роль кофакторов, хотя их не относят к коферментам; в ряде случаев ионы металлов прочно связаны с белковой молекулой и выполняют функции простетической группы. Например: фермент, катализирующий окисление витамина С (аскорбиновой кислоты) в дезоксиаскорбиновую кислоту, содержит 8 атомов меди на молекулу. Все они прочно связаны с белковой молекулой, даже не обмениваются ионообменными смолами и не отделяются путем диализа. Доказано, что ионы меди принимают участие в переносе электронов.

Коферментами являются витамин PP (никотинамид), B₂ (рибофлавин), пантотеновая кислота, фолиевая кислота, биотин (витамин H), B₁ (тиамин), B₆ (пиридоксин), B₁₂ (цианкобаламин), витамин Q (убихинон); они связаны с нуклеотидами (НАД, НАДФ, ФМН, ФАД, KoA, ТДФ, ПФ и т.д.).

Кофакторами могут быть соединения, не являющиеся витаминами: HS -глутатион, АТФ, липоевая кислота, производные нуклеозидов (уридинфосфат, цитидинфосфат, фосфоаденозинфосфосульфат), порфиринсодержащие вещества и др. Сюда же могут быть отнесены т-РНК, которые в составе фермента аминоацил-т-РНК-синтетазы принимают участие в синтезе белка.

Следует подчеркнуть, что ни кофермент, ни апофермент в отдельности каталитической активностью не обладают. Лишь в виде комплекса они проявляют свою активность фермента.

 

Активный центр фермента

Молекула фермента, особенно у сложных ферментов, является очень крупной и при взаимодействии с субстратом в контакт входит лишь ее ограниченная часть – активный центр фермента. В активном центре фермента различают каталитический участок, непосредственно вступающий в химическое взаимодействие с субстратом и "контактную" (якорную) площадку, которая обеспечивает специфическое сродство к субстрату и формирование его комплекса с ферментом (рис. 4.1.).

 

 

Рис.4.1. Образование фермент-субстратного комплекса.

 

Выявление химической природы и топографии групп активного центра является важной проблемой – необходимо определить первичную структуру и взаиморасположение аминокислот в активном центре. Для решения этого вопроса применяют различные приемы (ингибиторы, частичный гидролиз и т.д.).

Сейчас известно, что первичная структура активного центра определяется генетически, что реализуется при синтезе белка в рибосомах. Любое воздействие, связанное с денатурацией, приводит к нарушению активного центра и соответственно к потере ферментативной активности. Если удается восстановить третичную структуру фермента, то восстанавливается функция активного центра, что было доказано для рибонуклеазы поджелудочной железы.

Ферменты имеют 1,2 и более активных центра. Фермент уреаза имеет 3 активных центра, а холинэстераза – 20 активных центров. Активный центр состоит из 8-10 аминокислотных остатков, чаще всего в него входят серии, гистидин, тирозин, триптофан, глутаминовая кислота.

В молекуле фермента различают также аллостерический центр (греч. аллос – другой, стериос – пространственный). Ферменты, активность которых контролируется состоянием как активного, так и аллостерического центра, получили название аллостерических ферментов, их называют также регуляторными ферментами.

Ферменты, имеют множественные молекулярные формы, которые называют изоферменты и гетероферменты.

Изоферментами (изоэнзимами) называют белки, обладающие ферментативной активностью и катализирующие одну и ту же реакцию. Они встречаются у одного и того же вида, но отличаются между собой физико-химическими свойствами. Некоторые из них различаются между собой сродством к субстрату, коферменту и ингибитору. Например, лактатдегидрогеназа (ЛДГ) осуществляет превращение молочной и пировиноградной кислот, имеет Мм 140000 Да, ее молекула состоит из четырех субъединиц. Различают ЛДГ-1, содержащийся в мышечной ткани сердца, и ЛДГ-2 в мышечной ткани скелета; они различаются по электрофоретической подвижности.

Гетероферментами называют каталитические молекулы белков, различающиеся по размерам молекул. Ферменты, выполняющие одинаковые функции, могут встречаться в различных формах не только у различных животных, у различных органов одного и того же животного, но и в разных частях клетки.

Изоферментам принадлежит роль в регуляции отдельных звеньев обмена веществ. Например: изофермент лактатдегидрогеназы из сердечной мышцы (ЛДГ-1) резко тормозится пируватом, а скелетной мышцы – ЛДГ-2- менее чувствителен к нему.