После экстрагирования белков, т.е. перевода в растворенное состояние, приступают к разделению, фракционированию смеси белков на индивидуальные белки. Для этого применяют методы:
• высаливания;
• осаждения органическими растворителями;
• тепловой денатурации;
• хроматографии;
• гель фильтрации;
• ультрацентрифугирования;
• кристаллизации;
• электрофореза;
• распределения в двухфазных системах.
Как известно, растворение белков в воде связано с гидратацией отдельных молекул, что приводит к образованию вокруг белковой молекулы водных (гидратных) оболочек, состоящих из ориентированных в определенной форме в пространстве молекул воды. Эта вода (гидратной оболочки) отличается от чистого растворителя. Растворы белков отличаются крайней неустойчивостью и под действием разнообразных факторов, нарушающих гидратацию, белки легко выпадают в осадок. Поэтому добавление к раствору белка любых водоотнимающих средств (спирт, ацетон, концентрированные растворы нейтральных солей щелочных металлов), а также воздействие физических факторов (нагревание, облучение) приводит к дегидратации молекул и их выпадению в осадок.
Высаливание. При высаливании белка солями щелочных и щелочноземельных металлов белок обычно не теряет способности растворяться вновь в воде после удаления солей (диализом, гельфильтрацией). Например: глобулины выпадают в осадок при 50% насыщения, а альбумины при 100% насыщении раствора сульфатом аммония. При выпадении белковой молекулы в осадок, большое значение имеет не только концентрация солей, но температура и ионная сила раствора.
Методы хроматографии. Метод хроматографии, разработанный в 1903 г. русским ученым М.В. Цветом, основан на способности пигментов (или др. веществ) специфически связываться с адсорбентом, заключенном в колонке; используются также процессы сорбции и десорбции. Применяют различные методы хроматографии – адсорбционную, распределительную, ионнобменную.
Адсорбционная хроматография – адсорбентом является активированный уголь, окись алюминия или кремния. Широко применяются для разделения белков и другие вещества.
Распределительная хроматография. При этом твердая фаза является только носителем для жидкой фазы. Виды: хроматография на бумаге, на колонках, где в качестве стационарной фазы применяют крахмал или селикагель.
Ионообменная хроматография. Ионообменные смолы являются полимерными органическими соединениями, содержащими функциональные группы, способные вовлекаться в ионный обмен.
Различают анионообменники (органические основания и амины), катионообменники, содержащие фенольные, сульфо-и карбоксильные группы. Широко применяются диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ-целлюлоза), триэтиламиноэтил (ТЭАЭ) и аминоэтил (АЭ) - целлюлозы.
Аффинная хроматография (или хроматография по сродству) основана на принципе избирательного взаимодействия белков со специфическими веществами, закрепленными на носителе. В качестве носителя применяют активированную бромцианом сефарозу (CNBr-сефароза), к которой присоединяют различные вещества – субстрат, кофермент, антиген, гормон и т.д. Метод позволяет одноэтапно получить высокоочищенный препарат белка.
Гель-фильтрация или метод молекулярных сит – широко применяется для очистки белков от примесей.
С помощью сефадекса (декстран, полисахарид микробного происхождения, обработанный для разделения белков) можно разделить белки с разной молекулярной массой, так как зерна сефадекса разных номеров имеют различного размера поры, в которые способны проникать белки с определенной молекулярной массой.
Метод электрофореза основан на различии в скорости движения белков в электрическом поле, которая определяется величиной заряда белка при определенных рН и ионной силе раствора. Первоначально метод разработан А. Тизелиусом, в последнее время широко применяется метод зонального электрофореза белков на различных носителях – на бумаге (целлюлозе), крахмале, в полиакриламидном геле. Метод диск-электрофореза в полиакриламидном геле позволяет получить до 50 фракций белков, т.е. имеет очень высокую разрешающую способность.
Изоэлектрическое фокусирование белков – на амфолинах позволяет выделить индивидуальные белки в препаративных количествах.
Ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы или хлорида цезия получило широкое применение для очистки, а также определения молекулярной массы белков по константе седиментации (единица Сведберга - S).
Очистка белка от низкомолекулярных примесей достигается методом диализа, гельфильтрации, кристаллизации, ультрафильтрации. При диализе применяют полупроницаемые мембраны (целлофан, коллоидиновая пленка), диаметр пор которой варьирует в широких пределах. Белки, как правило, через такую мембрану не диффундируют, а низкомолекулярные вещества легко проходят через нее в окружающую среду. Наилучшие результаты дают методы гельфильтрации и ультрафильтрации, т.к. дают возможность, как освободиться от низкомолекулярных компонентов, так и сконцентрировать белки.
Методы определения гомогенности белков. Наилучшие результаты дают ультрацентрифугирование в градиенте плотности, диск-электрофорез в полиакриламидном геле, иммунохимические методы.
