Атомно-силовая электронная микроскопия

Методы 12 и 13 позволяют на наноуровне изучать даже живые клетки.

2. Цитохимические - позволяют определить начальный и конечный химический состав клетки, а также пространственно-временную организацию метаболизма в клетке, его статику и динамику.

1). Методы специальной микроскопии (интерференционная, люминесцентная, ультрафиолетовая микроскопии).

2). Методы микроскопической цитохимии. Позволяют получить качественныю химическую интерференцию.

Суть метода состоит в том, что на цитологических препаратах проводятся специфические химические реакции: реакции на ДНК, реакция на РНК, на определенные ферменты. Однако некоторые реакции можно отработать в количественном варианте (то есть чтобы реактив взаимодействовал только с выявляемым веществом, и степень его связывания была пропорциональна количеству вещества), что позволяет определять методом цитофотометрииколичество вещества в определенных клеточных компонентах (например, в различных участках хромосомы).

3). Методы количественной цито- и гистохимии. В отличие от второй группы методов, где анализ соединений проводится в клетке на месте их постоянного нахождения, в этом случае реакции проводятся в экстрактах. Однако в отличие от методов биохимических, где экстракты получают из всей навески, часто содержащей даже разные типы клеток, в нашем случае экстракты получают из небольшого количества абсолютно одинаковых клеток, или даже одной отдельно взятой клетки, выделенной с помощью микромолекулятора.

4). Иммунохимический метод – самый специфический из всех существующих в биологии методов, так как он базируется на самой специфической реакции – образование специфического антитела по отношению к антигену. Суть метода: в организм животного вводят антиген, по отношению к которому хотят получить антитела. Синтезированные в организме антитела выделяют в чистом виде после забоя животного. Современные методы молекулярной биологии и генной инженерии позволяют получать моноклональные антитела в громадных количествах (используя гибридомы).

Метод молекулярных маркеров жизненноважен для многих людей. Метод превращается в метод меченных антител или иммунофлуорисцентный метод. Таким образом, метод сочетает в себе свойства самого чувствительного и самого специфического.

Конфокальная люминесцентная микроскопия – изучает топологию клетки. Метод очень чувствителен, специфичен.

5). Метод радиоавтографии. Это единственный метод, позволяющий получить информацию о временной организации метаболизма клетки, то есть о скорости их синтеза и распада. Используют меченные атомы (радиоактивные изотопы) для синтеза необходимых метаболитов.(Например:если нужно исследовать синтез РНК, то таким метаболитом должен быть урацил, если ДНК – тимин. Но помечены они могут быть либо тритием (Н3-тимидин, Н3-урацил) либо фосфором. Для синтеза аминокислот используют С14 либо S35. На втором этапе используют меченные метаболиты –исследуют динамику метаболизма в культуре клеток, либо вводят в организм. Используя темпоральные фиксации, получают образцы, зафиксированные в определенные промежутки времени. Также используя такие фиксации на препаратах, выявляют с какой скоростью вещество включается в какие-то части клетки. Для изготовления препаратов используют клетки из зафиксированных образцов, а наверх на предметное стекло наносят слой фотоэмульсии. После определенной экспозиции проявляют эмульсию. Под микроскопом видны одновременно клетки, либо их участки, зоны и зерна потемневшей фотоэмульсии – в местах наиболее интенсивного включения изотопов. Такой препарат называется радиоавтографом.

3. Цитофизиологические 1).Метод культуры клеток и тканей (создание банка генов).

2). Метод микроманипуляции (микрохирургия) – с помощью специального прибора – микроманипулятора. Можно удалять либо вносить какие-то части клеток, либо можно вводить или удалять какие-то вещества (часть цитоплазмы).

3).Метод цейтрафферной микросъемки. Позволяет ускорить процессы (медленнотекущие сделать быстротекущим) на пленке, либо наоборот.