Обзор цитологических методов исследования

Т.к. цитология-это наука о клетке,а клетка-это элементарная структурная и функциональная единица жизни.Цитология изучает структуру, функции и химический состав клетки. Поэтому все методы изучения клетки, методы цитологических исследований можно разделить на три группы:1.цитоморфологические (позволяющие изучать структуру клетки);2.цитохимические (с помощью которых можно изучать не только химический состав клетки, но и процессы обмена веществ);3.цитофизиологические (позволяющие изучать функции клетки и ее компонентов).

1. Цитоморфологические -позволяют изучать строение клетки и ее компонентов. Выделяют: прямые (позволяют увидеть клетку) и косвенные (позволяют получить некоторые сведения об организации морфологических структур).Прямые:

1).Световая микроскопия – в проходящем свете.

2).Фазово-контрастная микроскопия (ФКМ) – позволяет увидеть живую (неокрашенную) клетку; вся информация, которую получает человеческий глаз, связана с амплитудой колебания. Если клетка окрашена, то амплитуда колебания уменьшается, падение яркости. Если клетка не окрашена, то изменяется фаза колебания. Т.к. человеческий глаз не видит эти изменения, этот метод позволяет увидеть изменения фазы колебаний. Если фаза колебаний совпадает, то происходит усиление яркости. Если фазы не совпадают, то происходит падение яркости. В ФКМ живые препараты освещаются не сплошным пучком света, а используется узко-пучковое освещение полным световым конусом так, что лучи диафрагмировавшие и не диафрагмировавшие вступают в объектив и падают на сетчатку глаза раздельно.При интерференции на сетчатке глаза происходит превращение фазовой картины строения живого препарата (не воспринимаемой человеческим глазом) в амплитудную картину строения препарата, воспринимаемую человеческим глазом как различие в яркости. Фазовое кольцо объектива всего лишь усиливает контраст изображения, так как оно поглощает часть недифрагировавших световых лучей, обеспечивая дополнительный сдвиг фазы.

3).Интерференционная микроскопия. Микроскоп имеет почти такое же устройство и базируется на том же принципе, но позволяет определить величину сдвига фаз - Dj; Djвсегда пропорционально концентрации сухого вещества в клетке. Поэтому по специальным таблицам можно рассчитать количество вещества в клетке, то есть взвесить живую клетку.ЭкстрагируяДНК ДНКзой, РНК – РНКзой, по разнице сухой массы до и после экстрагирования можно определить количество ДНК, РНК в клетке.

4).Ультрафиолетовая микроскопия. Используются в качестве источника света ультрафиолетовые лучи. Отличия – по источнику света, по линзам (кварцевые линзы), по способу регистрации изображения (на флуоресцирующем экране). Максимум спектра поглощения большинства биологических соединений расположен в области ультрафиолета, поэтому используется ультрафиолет с длиной волны 265нм для РНК и ДНК. Таким образом, этот метод позволяет проводить не только начальный анализ (для белков с длиной волны 280-320нм), но и количественный анализ.

5).Люминесцентный микроскоп. От обычного отличается только тем, что используются красители флуорохромы либо люминофоры и специальные фильтры. Для выделения спектра возбуждения – запирающие фильтры – для поглощения лучей возбуждающего спектра. Метод люминесцентного анализа является самым чувствительным – позволяет обнаружить примеси в несколько молекул, позволяет определять различные соединения в клетке в виде небольших примесей. Разновидностью люминесцентного микроскопа является конфокальный.

6).Темнопольная микроскопия. Позволяет исследовать живые неокрашенные и неконтрастные биологические объекты. Базируется метод на использовании эффекта Тендаля, используемого в физколлоидной химии, для исследования частиц коллоидного раствора, размеры которых ниже разрешающей способности микроскопа – минимальное расстояние между двумя точками, которые могут быть видны (разрешены) раздельно (не сливаются друг с другом). Теоретический предел для светового микроскопа равен половине длины волны используемого источника излучения. У этого микроскопа особая конструкция конденсора. На черном фоне видны светящиеся частицы.

7).Исследование препаратов в отраженном свете. Для исследования толстых непрозрачных препаратов используется их освещение сверху. Структура – параболическое зеркало, отражающее свет. В центре объектив, позволяющий в отраженных лучах исследовать структуру препарата.

Косвенные: 8). Поляризационная микроскопия. Отличается от обычного наличием двух оптически активных призм (призмы Николя), поляризующих световой пучок. Одна призма помещается до препарата (поляризатор), другая – после препарата (анализатор). При скрещенных поляризаторе и анализаторе под углом 90 (свет в поле зрения микроскопа отсутствует) некоторые биологические препараты или их определенные зоны могут вызывать появление света и определенных оптических эффектов (крестообразные структуры, и другие). Эти препараты называются анизотропными (вращают плоскость поляризации).Такими препаратами являются структуры, построенные из упорядоченных надмолекулярных образований (миофибриллы мышечного волокна, микротрубочки ахроматинового веретена деления, крахмал в крахмальных зернах, и др.).

9).Методы анализа пространственной организации молекул. (Рентгено-структурный анализ. Ультрафиолетовая и инфракрасная спектроскопия. Метод кругового дихроизма и др.) Инфракрасные спектры молекул называются ''паспортом'' химического соединения, так как позволяют их идентифицировать среди большой массы других соединений. Метод кругового дихроизма и др. позволяют определить пространственную ориентацию атомных группировок молекул, то есть морфологию молекул.

10).Электронная микроскопия. Отличается от обычного тем, что для анализа изображения используется не поток света, а поток электронов, и фокусируются эти лучи не линзами, а электромагнитными катушками. Поэтому принцип построения изображения изменяется.Препараты контрастируют электронно-плотными веществами – ионами тяжелых металлов (Os, Pt, Au и др.). Различают: 1.изучение ультратонких срезов. 2.метод замораживания-скалывания (исследуют рельеф поверхности, вид сверху). 3.метод негативного контрастирования. 4.метод реплик. 5.метод напыления коллоиднымAu, Pt.

11).Сканирующая электронная микроскопия. Электронный пучок сканирует, а затем, отражаясь, дает картину поверхности.