Мікроскопічні дослідження у вірусології, об’єкти досліджень, мета цих досліджень, основні методи

Методи лабораторної діагностики вірусних інфекцій наступні.

1. Мікроскопічний метод дослідження: а) в світловому мікроскопі; б) в люмінесцентному мікроскопі; в) в електронному мікроскопі.

2.Виділення і культивування вірусів шляхом зараження курячих ембріонів, лабораторних тварин і культур клітин.

3.Серологіческій метод дослідження (ідентифікація вірусів) - постановка серологічних реакцій (РЗГА, РН та ін.).

4. Біологічний метод.

5. Генетичні методи (ПЛР, рестрикційний аналіз).

Мікроскопію в світловому мікроскопі проводять з метою виявлення великих вірусів-віріонів, внутрішньоклітинних включень і вивчення патологічних змін клітин, уражених вірусами (ЦПД). Віріон - це зрілий позаклітинний вірус. Включення являють собою вірусний матеріал, що знаходиться всередині клітини, в утворенні якого беруть участь і клітинні продукти. Віріони можуть бути виявлені в мазках і препаратах-відбитках з інфікованої тканини; включення - тільки в препаратах-відбитках та гістозрізів, приготованих з уражених органів і тканин.

Віспа овець, свиней і корів, ектома овець, віспа-дифтерит птахів - це такі інфекції, при яких виявлення віріонів-збудників набуло діагностичне значення. Для виявлення віріонів використовують методи фарбування, які дозволяють збільшити вірусну частку в розмірах і зробити її більш контрастною. З метою отримання хороших результатів використовують чисті знежирені предметні скельця. Препарати готують з ретельно подрібненого матеріалу або шляхом відбитків намагаючись зробити їх якомога тонше. При кожному вірусному захворюванні враховують, які органи і тканини найбільш уражені які ділянки їх слід досліджувати, вибирають також відповідний метод фіксації. Існує ряд методів фарбування віріонів.

Забарвлення по Морозову застосовується в процесі діагностики віспи овець. Збудників хвороби виявляють в препаратах-відбитках, мазках із чистих суспензій. При дослідженні останніх на предметне скло пастерівською піпеткою наносять невелику краплю матеріалу і розподіляють її тонким шаром, для фарбування готують три реактиву.

Реактив №1 (фіксатор - рідина Руге): 2 мл 40% -ного формальдегіду (продажний формалін), 1 мл крижаної оцтової кислоти, 100 мл дистильованої води.

Реактив №2 (протруйник): 5 г таніну, 2 мл рідкого фенола, 100 мл дистильованої води (якщо з'являється осад, розчин фільтрують).

Реактив №3 (барвник): 5 г азотнокислого срібла розчиняють в 100 мл дистильованої води, потім обережно по каплям додають розчин 25% -ного аміаку до появи легкої опалесценції. Перед вживанням розводять дистильованою водою 1:10.

Готові препарати висушують на повітрі, 2... 3 хв відмивають дистильованою водою у вертикальному положенні. Затем на них наносять реактив №1, через 1 хв його зливають, мазок промивають і наносять на 1... 2 хв реактив №2, проводячи препарат над полум'ям спиртівки до появи парів. Далі мазок ретельно промивають дистильованою водою і на 1... 2 хв наносять реактив №3, прогріваючи препарат на вогні, поки він не стане темно-коричневим. Після цього препарат знову ретельно про-промивають водою, висушують на повітрі і мікроскопують.

На світло-коричневому тлі препарату віріони мають вигляд темно-коричневих або чорних крапок, розташованих поодиноко, попарно або у вигляді скупчень. Результат буде позитивним тільки в разі масового виявлення характерних утворень.

Забарвлення за Маккіавеллі зводиться до наступного. Висушені нефіксовані препараті забарвлюють 5 хв профільтрованним 0,25% -ним розчином основного фуксину, барвник зливають, а мазок швидко(1с) проводять через 0,5% -ний розчин лимонної кислоти, ретельно промивають водопровідною водою і фарбують5-10 з 1% -ним розчином метиленової сині. Потім препарат знову промивають, висушують і мікроскопують.

Віріони забарвлюються в яскравий рубіново-червоний колір, цитоплазма клітин - в світло-синій, ядра - в темно-синій.

Забарвлення за Романовським-Гімзою полягає в тому, що препарати фіксують в метиловий спирт 5 хв, наносячи на них розчин фарби Романовського-Гімзи (1 мл маточного розчину на 10... 15 м. Дистильованої води), фарбують 30... 60 хв, фарбу зливають і ретельно промивають дистильованою водою протягом 10... 15 хв. Висушені препарати краще провести через абсолютний спирт, толуол і укласти в бальзам. Віріони при цьому способі фарбування набувають темно-фіолетовий колір, фон препарату - блакитний.

При деяких вірусних інфекціях діагностичним признаком є утворення в клітинах особливих включень. Вони виявляються при сказі, віспі, грипі свиней, чумі собак та ін. Спеціальними методами забарвлення виявляются як внутрішньоплазматичний, тиск і внутрішньоядерні включення. Найбільш часто вони використовуються при діагностиці сказу.

Забарвлення за Муромцеву. Препарат фіксують метиловим спіртом, відмивають від фіксатора і забарвлюють 10 хв синькою Мансона (в 100 мл киплячої дистильованої веди розчиняють 5-6 г хімічно чистої бури, додають 2 г метиленової сині, охолоджують і фільтрують) в розведенні 1:40. Непромитий мазок ви-витримують в 10% -ому розчині таніну до тих пір, поки він не придбає замість синьо-фіолетового кольору блакитний. Потім його промивають водою, висушують фільтрувальним папером і протягом декількох секунд проводять через абсолютний спирт. Після цього висушують і мікроскопують. Включення Бабеша-Негрі являють собою фіолетові освіти різних розмірів (0,2... 20 мкм) і форми на блакитному тлі цитоплазми, ядра клітин фарбують в синій колір.

Забарвлення по Манну. Препарат фіксують в рідині Буена 2 год і забарвлюють 4 год при 37 ° С або 18 годин при кімнатній температурі в розчині наступного складу:

17мл 1% -ного розчину метиленової сині, 23 мл 1% -ного розчину еозину, 40 мл дистильованої води. Розчин готують перед вживанням. Після фарбування препарат ретельно промивають і зневоднюють в трьох розчинах лужного спирту: 1) до 30 мл абсолютного спирту додають 30 крапель 1% -ного розчину каустичної соди в цьому спирті, 2) до 30 мл абсолютного спирту додають 20 крапель розчину соди, 3) до 30 мл абсолютного спірта додають 10 крапель розчину соди. Зневоднення припиняють, якщо препарат приймає світло-рожевий відтінок. Такий препарат проводять через абсолютний спирт і зневоднюють в кислому спирті (30 мл абсолютного спирту і 1 крапля ледяной оцтової кислоти). На тлі блакитних клітин видно яскраво-червоні включення, сині ядра і ядерця клітин.

Забарвлення за Туревич. Препарат фіксують в метиловий спирт. Для проведення забарвлення необхідно мати такі реактиви: залізний гематоксилін Вейгерта, 1% -ний водний розчин кислого фуксину, насичений розчин пікринової кіслоти, розведений навпіл 96 ° спиртом.

Для отримання железного гематоксиліном Вейгерта готують два склади: 1) 1% -ний розчин гематоксиліном в 96 ° спирті. Розчин повинен дозрівати протягом 2... 3 тижнів;

2) 1,16 г хлористого заліза, 98 мл дистильованої води і 1 мл концентрованої соляної кислоти. Перед вживанням змішують рівні кількості обохрозчинів. Як тільки суміш набуває фіолетовий відтінок, її наносять на препарат і забарвлюють 1... 2 хв, промивають дистильованою водою. Потім фарбують 1% -ним водним розчином кислого фуксину протягом 1 хв і ретельно промивають дис-тіллірованной водою до появи блідо-рожевого відтінку. Після промивкі диференціюють розчином пікринової кислоти протягом 10 - 20 с до появи жовтого відтінку. Препарат швидко прополаскують в дистильованої води і злегка обсушують фільтрувальним папером, проводять через абсолютний спирт або ксилол і укладають в бальзам. Тільця Бабеша-Негрі - вишнево-червоного кольору, ядра клітин - чорні на сіро-жовтому фоні цитоплазми.

Крім зазначених методів, для виявлення включень можна використовувати фарбування за Романовським-Гімзою. Включення при цьому набувають темно-фіолетовий колір, цитоплазма - блакитний.