Перше й головне твердження щодо процесу укладання поліпептидного ланцюга в нативну глобулу полягає в тому, що просторова структура нативного білка і шлях її формування повністю визначаються амінокислотною послідовністю, і тільки амінокислотною послідовністю. Процес укладання білка в нативну структуру – це пошук конформації, яка відповідає мінімуму вільної енергії для даної послідовності амінокислот, і, відповідно, є найстабільнішою. Певне уявлення просвоєрідний енергетичний ландшафт, що відповідає загальному набору різноманітних конформацій амінокислотного ланцюга, дає рис. 33 (зрозуміло, що насправді кількість конформаційних координат значно більше двох – конформаційний простір є багатовимірним).
Нативна структура глобулярного білка завжди відокремлена від інших конформацій особливо глибоким мінімумом – знаходиться в енергетичній ямі (рис. 33). Наявність такої ями, яка відповідає стабільному щільно упакованому гідрофобному ядру, забезпечує надійність функціонування білка: теплові флуктуації не здатні вивести структуру з такої ями.
Величезна кількість конформацій, у принципі доступних для поліпептидного ланцюга, поставила проблему, відому як парадокс Левінталя (Cyrus Levinthal). Якщо кожен амінокислотний залишок має ~10 конформацій, ланцюг зі 100 залишків – 10100 конформацій. За найнижчою оцінкою перемикання однієї конформації відбувається за ~10–13 с, тобто, щоб перебрати всі конформації потрібно щонайменше 1080 років, що значно перевищує вік Всесвіту. Аналогія конформаційного простору з ландшафтом (рис. 33) відразу дає рішення цього парадоксу: річка не перебирає увесь ландшафт, вона просто тече одним або кількома альтернативними низькими руслами, впадаючи врешті решт у найнижчу яму. Так само й для поліпептидного ланцюга існують певні виділені”шляхи укладки, які відповідають ієрархії структури білка.
Спочатку за рахунок локальних взаємодій утворюються елементи вторинної структури з гідрофобними поверхнями. Водночас завдяки гідрофобних взаємодій вони злипаються між собою, утворюючи розплавлену глобулу. Цей процес відбувається досить швидко – за кілька мікросекунд. На другому етапі, який потребує значно більшого часу (кілька секунд чи навіть хвилин), реалізується щільна упаковка глобули за рахунок вандерваальсових взаємодій з утворенням твердої нативної молекули, що відповідає глобальному мінімуму вільної енергії.
Конформація ланцюга змінюється, прямуючи через локальні мінімуми енергії, які відокремлені один від одного невисокими бар’єрами. Бар’єри легко долаються за рахунок теплових флуктуацій, і ланцюг нарешті опиняється у глибокому глобальному мінімумі. Але на такому шляху можливі енергетичні пастки (рис. 34) – досить глибокі мінімуми, з яких неможливо вибратися за розумний час, оскільки глибина такої локальної ями перевищує енергію теплових флуктуацій.
Однією з головних причин виникнення енергетичних пасток є агрегація поліпептидних ланцюгів. У стані розплавленої глобули, яка відрізняється від нативної великомасштабними рухами своїх частин, час від часу відбувається вихід на поверхню значної частини гідрофобних залишків. Відповідно, недоструктуровані поліпептидні ланцюги будуть прагнути утворити великі неспецифічні агрегати з метою заекранувати неполярні групи від молекул води. Агрегат і є пасткою – опиняючись у мінімумі вільної енергії, він практично не допускає дисоціації своїх елементів і не дозволяє їм продовжити процес пошуку нативної структури. Зрозуміло, що ефективність агрегації зростає при підвищенні концентрації поліпептидів, а також при зростанні температури (яке підсилює і рухливість глобули, і гідрофобні взаємодії).
Рис. 33. Схематична тривимірна проекція конформаційного простору поліпептидного ланцюга – залежність вільної енергії (G) від двох параметрів (q1, q2), які характеризують конформацію ланцюга.
Рис. 34. Енергетична пастка на шляху укладання поліпептидного ланцюга вздовж однієї конформаційної координати (див. рис. 33).
Повертаючись до сформульованої вище догми про визначення шляху укладки білка його первинною структурою, слід зауважити, що процес укладки може просто не дійти до свого кінця. Численні експерименти in vitro свідчать про те, що догма повністю підтверджується: практично будь-який білок у денатурованому стані можна без жодних специфічних факторів ренатурувати – відновити його нативну структуру й функцію. Але успішна ренатурація є можливою, якщо штучно створити певні умови та режим її здійснення:
• Перш за все, бажано проводити ренатурацію поступово, повільно повертаючи зовнішні умови до фізіологічних. У результаті на проміжних етапах ренатурації будь-який локальний мінімум енергії не буде надто глибоким і не зможе спрацювати як енергетична пастка: ланцюг зможе швидко перебирати різні недуже стабільні конформації, реалізуючи конформаційну рівновагу, зсунуту до певного найнижчого мінімуму енергії.
• Другою важливою умовою є здійснення ренатурації при низькій концентрації білка – з метою запобігти неспецифічній агрегації. Крім цих загальних правил, у кожному випадку часто доводиться підбирати умови ренатурації окремо: визначати оптимальний режим зміни концентрації солі, температуру, концентрації субодиниць білка з четвертинною структурою тощо.
Зрозуміло, що все це неможливо здійснити in vivo – достатньо сказати, що загальна середня концентрація білків у клітині становить ~100 мг/мл або більше. Тобто клітинні умови є дуже агресивними для поліпептидного ланцюга, що перебуває у процесі пошуку своєї нативної конформації, і без спеціальних механізмів більшість білків просто не встигли б після свого синтезу таку конформацію знайти, швидко опинившись у складі агрегату. Такі механізми – створення рівноважних умов поступового пошуку нативної структури та захист від агрегації – забезпечуються спеціальними білками – шаперонами (від фр.chaperon – капюшон, або особа, що супроводжує незайману дівчину).
Шаперони не визначають ані нативну структуру білка, ані шляхїї укладання – і те, й інше детермінується амінокислотною послідовністю. Головна функція шаперонів – забезпечити умови для швидкого пошуку нативної конформації, створюючи своєрідний інкубатор для неструктурованого поліпептидного ланцюга. Серед досить великої кількості шаперонів є специфічні – зокрема такі, що обслуговують процеси збирання мультибілкових комплексів і субодиничних білків. Більш універсальні шаперони відносять до родини hsp – білків теплового шоку (heat shock proteins). Білки hsp є загальним компонентом клітин для всіх таксономічних груп, у пойкілотермних організмів транскрипція на генах hsp активується у відповідь на зростання температури до 30 – 40 °С при гальмуванні транскрипції більшості інших генів (тепловий шок).
Шаперони hsp70
Процес укладання поліпептидного ланцюга у глобулу має відбуватися саме посттрансляційно – поза рибосомою. Тунель, через який синтезований ланцюг виходить за межі рибосоми має довжину ~100 Å, середній діаметр ~15 Å – у тунелі може розміститися тільки витягнутий ланцюг довжиною ~30 амінокислот. Отже, укладання не може починатися в тунелі. Білки hsp70 (тут і далі цифрами позначено молекулярну вагу в кілодальтонах) зв’язують розгорнутий поліпептидний ланцюг відразу після того, як його частина виходить з рибосоми при білковому синтезі. Молекула має два структурні домени – пептид-зв’язувальний, який взаємодіє з елементом розгорнутого поліпептидного ланцюга (рис. 35), та АТР-азний.
Рис. 35. Комплекс пептид-зв’язувального домену бактеріального hsp70 (білок DnaK) із фрагментом поліпептиду (червоний) довжиною 7 амінокислот (1DKZ). Стрілка вказує напрямок конформаційної зміни білка, яка індукується АТР.
Зв’язування з розгорнутим ланцюгом здійснюється неспецифічно за рахунок гідрофобних взаємодій з неполярними амінокислотними залишками: ланцюг вкривається –шубою – молекул шаперона. Власне, підтримання розгорнутого стану ланцюга при запобіганні агрегації – одна з основних функцій hsp70.
Молекула шаперону може існувати у двох структурних станах залежно від типу зв’язаного ліганду – АТР чи ADP. У комплексі з АТР реалізується структурна форма, яка допускає швидку рівновагу між зв’язаним / дисоційованим поліпептидом. Гідроліз АТР (здійснюється АТР-азним доменом hsp70 за сприяння ко-шаперонів hsp40) викликає структурну зміну з міцною фіксацією поліпептиду пептид-зв’язувальним доменом. За допомогою інших ко-шаперонів ADP знову замінюється на АТР (рис. 36).
У процесі такої циклічної АТР-залежної зміни спорідненості шаперону до поліпептиду створюються умови для рівноважного пошуку нативної конформації під час короткострокової дисоціації. Цей механізм є цілком аналогічним зі збиранням хроматину за допомогою проміжних переносників гістонів, які також називають хроматиновими шаперонами: звільнений поліпептид з нестабільною структурою (з великою кількістю гідрофобних залишків на поверхні) знов розгортається hsp70 і здійснює нову спробу при наступній дисоціації. Для багатьох білків такий процес виявляється достатнім, щоб знайти нативну конформацію – структуру з гідрофобним ядром у середині, яка не може бути субстратом для hsp70. Іноді процес укладки поліпептидного ланцюга відбувається котрансляційно: укладається С-кінцева частина ланцюга, яка вже вийшла з рибосоми, тоді як решта поліпептиду ще синтезується. Зокрема, такий процес іноді спостерігається для мультидоменних білків. Інші поліпептиди переносяться на інші шаперони (наприклад, на шапероніни, див. нижче), частина нестабільних білків, звільняючись від hsp70, піддається протеолітичній деградації.
У складі міцного комплексу з hsp70·АDР поліпептид транспортується крізь мембрану до інших компартментів клітини, у середину мітохондрій, до місця збірки мультибілкових комплексів тощо: близько третини всіх синтезованих білків мають бути транспортованими в інше місце клітини або секретованими в позаклітинний простір. Транспортування комплексу поліпептиду з hsp70 відбувається за рахунок наявності у складі ланцюга специфічних сигнальних послідовностей (які відщеплюються в місці призначення), що упізнаються білковими факторами та шаперонами типу hsp90.
Рис. 36. АТР-залежний робочий цикл hsp70.
У деяких випадках hsp70 та аналогічні білки теплового шоку беруть участь у контролі активності регуляторних білків. Першим прикладом є система регуляції транскрипції самих білків теплового шоку пойкілотермних організмів. За низьких температур фактор транскрипції HSF (Heat Shock Factor) перебуває в неактивній формі – у недоструктурованому вигляді в комплексі з білками hsp40, hsp70, hsp90, які синтезуються за рахунок фонової активності своїх генів. Підвищення температури, яке зумовлює дестабілізацію багатьох білків і експонування гідрофобних груп у їхньому складі, викликає зв’язування hsp з цими білками – HSF звільняється, набуває остаточної структури і зв’язується з промоторами генів hsp, активуючи їхню транскрипцію. Підвищення концентрації hsp знов інактивує HSF.
Інший приклад залучення білків теплового шоку до регуляції транскрипції вже розглядався у зв’язку з гормоновими рецепторами: після синтезу рецептора hsp70 (що зв’язується з його ланцюгом після виходу з рибосоми) замінюється на hsp90 та ко-шаперон р23, і в складі цього комплексу гормон-зв’язувальний домен підтримується в недоструктурованому стані до моменту зв’язування з гормоном.
Шапероніни
Особливий клас шаперонів, побудованих із білків hsp60, об’єднують у групу шаперонінів. Бактеріальний шаперонін (шаперонін І) містить два комплекси, кожен з яких сформований сімома молекулами hsp60 (інша назва GroEL). Комплекс має форму кільця з каналом ~45 Å у діаметрі, утворюючи своєрідну мікропробірку (рис. 37), яка може закриватися кришечкою, утвореною із 7 молекул hsp10 (інша назва GroES).
Рис. 37. Структура шапероніну GroEL (1WE3) у різних проекціях. Два семичленних кільця hsp60 зафарбовані зеленим і червоним,7 субодиниць hsp10 – синім.
Еукаріотичні аналоги (шапероніни ІІ) мають подібну будову, але кожне кільце формується з восьми або дев’яти субодиниць, додаткові структурні домени яких утворюють кришечку, що закривається / відкривається в результаті структурних перебудов.
Кожна субодиниця кільця, і на цьому базується принцип роботи шапероніну, існує принаймні у двох структурних формах (рис. 38). Перша (у двох варіантах, що трохи розрізняються) реалізується в комплексі з АТР або ADP і характеризується: 1) високою спорідненістю до hsp10 (що сприяє утворенню кришечки); 2) низькою гідрофобністю своєї поверхні. Дисоціація ліганду (ADP після гідролізу АТР) індукує структурну перебудову зі взаємним переміщенням трьох структурних доменів. При цьому втрачається спорідненість до hsp10 (відкриття кришечки) і на внутрішню поверхню білка (усередині каналу мікробірки) експонуються гідрофобні групи.
Рис. 38. Два структурні стани hsp60 (1WE3): зв’язаний з ADP у комплексі з молекулою hsp10 (червоний) і вільний від ліганду (зелений).
Зв’язування та гідроліз АТР, дисоціація ADP і відповідні перебудови відбуваються синхронно для семи субодиниць одного кільця (позитивна кооперативність у межах кільця), але два кільця працюють за принципом негативної кооперативності: перший стан одного кільця сприяє реалізації другого стану в іншому кільці (як на рис. 37).
Робочий цикл шапероніну показано на рис. 39. Через відкритий отвір мікропробірки всередину потрапляє поліпептидний ланцюг. Кільце hsp60 (верхнє на рис. 39, розглянемо саме його) перебуває при цьому в стані, що не зв’язує жодного ліганду: кришечка відкрита, поліпептид фіксується всередині каналу в розгорнутому вигляді за рахунок гідрофобних взаємодій. Зв’язування семи молекул АТР викликає структурну перебудову: кришечка закривається, гідрофобність внутрішньої поверхні каналу зникає – поліпептид (повністю захищений від зовнішнього середовища) має змогу здійснювати власну укладку. На це він має ~20 с – час, поки існує зв’язаний АТР, після чого відбувається його гідроліз (за рахунок активності hsp60) і потім залишається зв’язаний ADP. Зв’язування АТР з нижнім кільцем індукує дисоціацію ADP від субодиниць верхнього: кришечка відкривається, і білок зі сформованою нативною структурою – гідрофобних груп практично немає на його поверхні й він не прилипає до стінок каналу – виходить через отвір мікробірки. Для більшості білків проміжок у 20 с є цілком достатнім, щоб знайти нативну конформацію. Якщо цього не відбулося, процес може повторитися.
Рис. 39. Робочий цикл шапероніну. Структуру схематично зображено в розрізі: для кожного кільця показано по дві субодиниці, кожна складається з трьох доменів. Червоний і зелений колір відповідають різним структурним станам кільця (як на рис. 37, 38), синій – hsp10.
КОНТРОЛЬНІ ЗАПИТАННЯ
1. Назвіть основні структурні елементи будови тРНК? Як саме вони розташовані у просторі? Які взаємодії стабілізують просторову структуру тРНК?
2. Якою хімічною групою тРНК акцептується амінокислота? Назвіть групу амінокислоти, що задіяна в цьому зв’язку.
3. Які хімічні реакції каталізує АРС-аза? Що таке активування амінокислоти?
4. Яким чином реалізується специфічність АРС-аз щодо тРНК та амінокислот?
5. Що таке рибосома? З чого вона складається? Опишіть основні риси просторової будови рибосоми.
6. Які функціональні сайти має рибосома? Їхнє розташування відносно один одного та щодо субодиниць рибосоми?
7. Як розподілені функції рибосоми між двома субодиницями?
8. Порівняйте структурні та функціональні особливості рибосомних РНК і білків.
9. З яких етапів складається елонгаційний цикл рибосоми?
10. Опишіть структуру та функціональне значення факторів елонгації EF1 і EF2.
11. У чому полягає роль гідролізу GTP при елонгації трансляції?
12. Як рибосома здійснює свою декодуючу функцію?
13. Що таке акомодація аа-тРНК на рибосомі та як саме вона відбувається?
14. У чому полягає реакція подовження поліпептидного ланцюга на одну амінокислоту? Як відбувається каталіз цієї реакції?
15. Яким чином відбувається транслокація рибосоми вздовж мРНК?
16. Яка стадія елонгаційного циклу є найшвидкішою?
17. Порівняйте системи ініціації трансляції у про- та еукаріотів.
18. Опишіть основні стадії термінації трансляції.
19. За якими механізмами здійснюється регуляція білкового синтезу?
20. Назвіть основні стадії процесу укладання білкової глобули. Якою вільною енергією має характеризуватися нативна конформація білка порівняно з іншими конформаціями? Що таке енергетична пастка; як вона може виникати?
21. У чому полягає функціональна роль шаперонів?
22. Опишіть робочий цикл шаперонів hsp70.
23. Визначте структурну організацію та робочий цикл шаперонінів.
РЕКОМЕНДОВАНА ЛІТЕРАТУРА
Киселев, Л.Л., Фаворова, О.О., Лаврик, О.И. Биосинтез белков от аминокислот до аминоацил-тРНК. – М.: Наука, 1984.
Финкельштейн, А.В., Птицын, О.Б. Физика белка. Курс лекций. – М.: КДУ, 2005
Andersen, G.R., Nissen, P., Nyborg, J. Elongation factors in protein biosynthesis // Trends Biochem. Sci. – 2003. – Vol. 28. – P. 434–441.
Bukau, B., Horwich, A.L. The hsp70 and hsp60 chaperone machines// Cell. – 1998. – Vol. 92. – P. 351–366.
Burbaum, J.J., Schimmel, P. Structural relationships and theclassification of aminoacyl-tRNA synthetases // J. Biol. Chem. – 1991. – Vol. 266. – P. 16965–16968.
Deuerling, E., Bukau, B. Chaperoneassisted folding of newly synthesized proteins in the cytosol // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. – 2004. – Vol. 39. – P. 261–277.
Frank, J., Sengupta, J., Gao, H. et al. The role of tRNA as a molecularspring in decoding, accommodation, and peptidyl transfer // FEBSLetters. – 2005. – Vol. 579. – P. 959–962.
Laursen, B.S., Sørensen, H.P., Mortensen, K.K., Sperling Petersen, H.U. Initiation of protein synthesis in bacteria // Microbiol. Mol. Biol. Rev. – 2005. – Vol. 69. – P. 101–123.
Mitra, K., Frank, J. Ribosome dynamics: insights from atomic structure modeling into cryoelectron microscopy maps // Annu. Rev. Biochem.Biomol. Struct. – 2006. – Vol. 35. – P. 299–317.
Moore, P.B., Steitz, T.A. The structural basis of large ribosomal subunitfunction // Annu. Rev. Biochem. – 2003. – Vol. 72. – P. 813–850.
Noller, H.F., Yusupov, M.M., Yusupova G.Z. et al. Translocation of tRNA-during protein synthesis // FEBS Letters. – 2002. – Vol. 514. – P. 11–16.
Ogle, J.M., Ramakrishnan, V. Structural insights into translationalfidelity // Annu. Rev. Biochem. – 2005. – Vol. 74, 129–177.
Ramakrishnan, V. Ribosome structure and the mechanism of translation// Cell. – 2002. – Vol. 108. – P. 557–572.
