Порівняльна характеристика двох класів АРС-аз

Центральна частина поліпептидного ланцюга АРС-ази формує активний центр (сайт зв’язування амінокислоти), в оточенні якого реалізується спільний для ферментів одного класу структурний мотив: для першого класу – укладка Россмана, для другого – приблизно плоский паралельний β-шар із семи β-ділянок (рис. 4).Як видно з табл. 2, амінокислоти з подібними властивостями часто є субстратами АРС-аз різних класів залежно від розміру амінокислот: великі потрапляють до першого класу, маленькі – до другого (наприклад, Tyr і Phe, Glu і Asp, Arg і Lys). Відповідно, активний центр АРС-аз першого класу розташований у порівняно неглибокій порожнині на поверхні ферменту, другого класу – у глибшому кармані.

Рис. 4. Структури АРС-аз першого (мономерна Glu-тРНК-синтетаза, 1G59) та другого (Asp-тРНК-синтетаза, гомодимер, 1ASY) класів.

Із частини молекули, яка утворює спільний структурний мотив, випетльовуються інші структурні домени, які, разом із N- або С-кінцевими доменами беруть участь у взаємодії з тРНК. АРС-ази двох класів упізнають різні елементи структури тРНК: маленький жолобок акцепторного стебла, D-петля та антикодонова петля для першого класу; великий жолобок акцепторного стебла, варіабельна та антикодонова петлі для другого (рис. 5). Причому специфічність упізнання тРНК залежить у першу чергу від взаємодій з акцепторним стеблом: штучна акцепторна частина (міні-тРНК) здатна специфічно зв’язатися з АРС-азою та акцептувати амінокислоту.

Рис. 5. Комплекси тРНК_Glu (1 клас, 1G59) і тРНК_Asp (2 клас, 1ASY) з відповідними АРС-азами. З димерною АРС-азою зв’язано дві молекули тРНК. На даній проекції видно лише одну з них.

Рис. 6. Подвійне сито на прикладі Ile тРНК-синтетази.

Специфічність зв’язування АРС-азою такого великого ліганду, як тРНК, не становить значної проблеми: велика кількість контактів дозволяє досить легко дискримінувати різні типи тРНК за рахунок різниці у вільній енергії зв’язування. Амінокислоти, навпаки, є маленькими лігандами (до того ж іноді з дуже схожою структурою), з яким неможливо реалізувати велику кількість взаємодій. Тим не менш, середня частота помилок при аміноацилюванні тРНК становить приблизно 10^–6 – такий рівень точності неможливо досягти просто за рахунок різниці у вільній енергії зв’язування, яка не може сильно відрізнятися для різних амінокислот. Відповідно, АРС-ази використовують певну систему корекції помилок за механізмом так званого подвійного сита. Наприклад, активний центр Ile-тРНК-синтетази (рис. 6) здійснює первинне вибракування частини амінокислот досить великого розміру на етапі зв’язування / активування, інші амінокислоти (включаючи Ile) піддаються активуванню. На другому етапі всі аміноациладенілати, що містять більш маленькі порівняно з Ile амінокислоти, гідролізуються в іншому активному центрі (центр редагування), а Ile переноситься на тРНК, оскільки його розмір не дозволяє йому зв’язатися з центром редагування. У результаті дуже близький до Ile за структурою Val акцептується тРНК_Ile в одному випадку з 180 тис. Інші АРС-ази можуть здійснювати редагування помилок уже після акцептування амінокислоти, коли аа-тРНК упізнається як ціле, і неспоріднена амінокислота відщеплюється.

Рибосома

Склад рибосоми

Рибосома – рибонуклеопротеїдний комплекс, який складається із двох субодиниць (рис. 7). Компоненти рибосоми прийнято позначати коефіцієнтами седиментації – коефіцієнтами пропорційності,що показують, наскільки зростає швидкість руху частинки при центрифугуванні зі зростанням відцентрової сили (швидкості обертання ротора центрифуги). Коефіцієнт седиментації використовується як міра рухливості частинки, залежить від її маси, об’єму та форми, вимірюється у сведбергах (S) – позастистемних одиницях, які мають розмірність часу (1S = 10^–13 с).

Маленька субодиниця прокаріотичної рибосоми з коефіцієнтом седиментації 30S, містить одну молекулу рРНК (16S) і 21 молекулу рибосомних білків, що позначаються як S1 – S21 (від Small subunit). Велика субодиниця містить дві молекули рРНК (23S і 5S) і білки L1 – L36 (від Large subunit) – цей комплекс седиментує з коефіцієнтом 50S. Об’єднання субодиниць дає рибосому з коефіцієнтом седиментації 70S – оскільки коефіцієнт седиментації залежить від форми частинки, він не є адитивною величиною. Еукаріотична рибосома містить трохи більшу 18S рРНК замість 16S, дві рРНК, що міцно взаємодіють між собою (28S і 5,8S), замість 23S і більшу кількість білків. Структура обох рибосом і принципи їхньої роботи подібні.

Рис. 7. Склад про- та еукаріотичної рибосом. рРНК позначено їхніми коефіцієнтами седиментації та довжиною в нуклеотидах (н).

Синтез еукаріотичних рРНК 18S, 5,8S і 28S здійснюється в ядерці, яке формується на тандемних повторах кластера відповідних генів рРНК. Первинний транскрипт, що синтезується РНК-полімеразою І, має константу седиментації 45S і містить три фрагменти майбутніх рРНК, розділені спейсерами. Процесинг рРНК – деградація спейсерів, а також модифікація певних основ і метилування 2′ ОН-груп специфічних рибоз – здійснюється за участю близько 150 типів маленьких ядерцевих РНК (snoRNA – small nucleolar RNA), які, аналогічно до маленьких ядерних РНК, визначають специфічні сайти деградації та модифікацій. Частина маленьких ядерцевих РНК синтезується на певних генах РНК-полімеразами ІІ та ІІІ. Але велика кількість цих РНК є інтронами, що визволяються в результаті сплайсингу мРНК білкових генів. 5S рРНК синтезується РНК-полімеразою ІІІ на окремих кластерах відповідних генів поза ядерцем. В ядерці, практично одночасно з процесингом рРНК відбувається її поступова взаємодія з рибосомними білками, до ядерця ж дифундує комплекс 5S рРНК з білками: утворюються субодиниці рибосоми, які далі транспортуються до цитоплазми.

Первинний транскрипт, що синтезується на бактеріальному рибосомному опероні, містить ділянки, які відповідають усім трьом прокаріотичним рРНК, а також кілька майбутніх тРНК. Часткова деградація транскрипту приводить до утворення зрілих молекул, які взаємодіють з рибосомними білками, формуючи дві субодиниці рибосоми. In vivo остаточне збирання рибосоми із двох субодиниць, як у про-, так і в еукаріотів, здійснюється при ініціації трансляції.

Структура рибосоми

Структуру рибосоми за результатами рентгеноструктурного аналізу її кристалів показано в різних проекціях на рис. 8–10, де також схематично зображено зовнішню анатомію субодиниць та їхнє розташування у складі рибосоми відносно одна одної та деяких інших елементів системи трансляції.

Рис. 8. Структура рибосоми Thermus thermophilus та її субодиниць (1GIX, 1GIY), показано лише основні ланцюги РНК і білків (білки пофарбовано зеленим). Окремі субодиниці орієнтовані інтерфейсами взаємодії між ними до глядача, у складі рибосоми орієнтація великої субодиниці збережена. Білою стрілкою позначено напрям зору, в якому структуру зображено на рис. 9. Унизу: схематичне зображення структур субодиниць та їхнього комплексу в тих самих проекціях, РТ – пептидилтрансферазний центр.

Від основного досить монолітного тіла великої субодиниці відходять три характерні відростки: виріст L1, палець (стебло) L7/12, сформовані відповідними рибосомними білками, і центральний протуберанець, утворений комплексом певних білків з рРНК 5S. Два окремі структурні домени – головка та платформа – відходять від тіла маленької субодиниці.

У складі рибосоми можна виділити три основні зони контактів між субодиницями: головка – центральний протуберанець; платформа – виріст L1; центральні частини основного тіла обох субодиниць. Усі структурні елементи рухливі: можливим є переміщення головки й пальця L7/12, обертання малої субодиниці навкруг нормалі до поверхні великої субодиниці на ~6° проти годинникової стрілки тощо. Рухи структурних елементів рибосоми в зонах контактів мають важливе значення для її функціонування, оскільки саме на інтерфейсі між субодиницями знаходяться всі активні центри та сайти взаємодії з елементами системи трансляції:

Рис. 9. Структура рибосоми та її субодиниць у комплекс із трьома молекулами тРНК з рис. 8 у іншій проекції – з боку входу аа-тРНК до А-сайта. Білою стрілкою позначено напрям зору, у якому структуру зображено на рис. 10. Унизу: схематичне зображення у тій самій проекції, крайня права схема – велика субодиниця в розрізі.

• В основі центрального протуберанця розташований пептидил-трансферазний центр (рис. 8, 9), який відповідає за каталіз реакції синтезу пептидного зв’язку. Від пептидил-трансферазного центру через тіло великої субодиниці відходить тунель – канал виходу поліпептидного ланцюга, що синтезується (рис. 9).

• В основі пальця L7/12 міститься сайт зв’язування G-білків (рис. 8) – факторів трансляції, детальне описання яких наведено нижче.

• У щілині між платформою та головкою маленької субодиниці відбувається взаємодія з мРНК (рис. 8, 9).

• Сайти зв’язування тРНК розташовані між двома субодиницями: антикодонові частини тРНК взаємодіють з мРНК і маленькою субодиницею, акцепторні частини – з великою субодиницею (рис. 9, 10). Рибосома містить три такі сайти: А-сайт, де відбувається зв’язування аа-тРНК; Р-сайт, де з рибосомою взаємодіє пептидилт-РНК (тРНК, до якої приєднаний пептидил – ланцюг, що синтезується); Е-сайт (від exit), де міститься деаміноацильована тРНК перед її звільненням з рибосоми.

Акцепторні частини тРНК, розташовані в А- і Р-сайтах, наближені одна до одної (рис. 10, 11) і взаємодіють з великою субодиницею в зоні пептидилтрансферазного центру. Кількість контактів з тРНК у Р-сайті є більшою, ніж кількість контактів, що утримують молекулу тРНК в А-сайті.

Рис. 10. Вид зверху (по стрілці на рис. 9) на структуру рибосоми та її субодиниць у комплексі з трьома молекулами тРНК.

Рис. 11. Взаємне розташування трьох молекул тРНК у рибосомі (дві проекції приблизно збігаються з проекціями на рис. 9 і 10).

Аа-тРНК потрапляє до рибосоми через щілину між субодиницями (рис. 9), розмір якої може змінюватись унаслідок рухливості структурних елементів рибосоми. Так само й розмір воріт, через які тРНК виходить із Е-сайта, модулюється рухливістю виросту L1. Функціональну схему рибосоми наведено на рис. 12: систему зображено в момент перед додаванням четвертої амінокислоти до ланцюга, що синтезується; показано аа-тРНК, пептидил-тРНК і деаміноацильовану тРНК, що зв’язані відповідно з А-, Р- і Е-сайтами. Центральні сайти, навколо яких відбувається вся робота рибосоми – сайти зв’язування тРНК – формуються обома субодиницями. Між субодиницями існує своєрідне відносне розділення праці: маленька субодиниця, яка взаємодіє з мРНК та антикодоновими частинами тРНК, відповідає головним чином за декодуючу функцію рибосоми, а велика, яка взаємодіє з акцепторними частинами тРНК – за каталітичну функцію. Рибосомні РНК становлять ~2/3 маси рибосоми й саме вони визначають її структуру та функції. Полінуклеотидний ланцюг рРНК утворює велику кількість подвійних спіралей, з’єднаних петлями, – переважно це шпильки, проте відбувається і спарювання між віддаленими по ланцюгу ділянками. Загалом ланцюг утворює складну просторову структуру, де подвійні спіралі взаємодіють одна з одною та з одноланцюговими ділянками. Зокрема, аденозини одноланцюгових ділянок досить часто взаємодіють з маленьким жолобком подвійних спіралей, стабілізуючи структуру.

У складі 16S рРНК близько половини нуклеотидів залучено до ~60 коротких дволанцюгових ділянок середньою довжиною вісім пар основ. Але зазвичай у складі 16S РНК виділяють 45 більш-менш суцільних (із короткими неспареними ділянками всередині) подвійних спіралей. За своєю загальною Y-подібною формою 16S рРНК майже не відрізняється від маленької субодиниці рибосоми (рис. 13, порівн. рис..8) – просторова структура чітко розділяється на чотири структурні домени: 5′-кінцевий формує тіло маленької субодиниці, центральний – платформу, так званий 3′-кінцевий мажорний домен – головку, 3′-кінцевий мінорний, який складається з довгої спіралі 44 (порядковий номер) і коротшої останньої спіралі 45, формує інтерфейс взаємодії з великою субодиницею. На цей РНК-скелет у складі маленької субодиниці нарощуються білки, однак загальна форма зберігається. При цьому сайти зв’язування мРНК і антикодонових частин тРНК формуються переважно 3′-кінцевою зоною 16S рРНК майже без участі білків; взаємодія між субодиницями також переважно забезпечується контактами РНК.

Рис. 8.12. Функціональна схема рибосоми: червоною стрілкою позначено напрямок руху при трансляції, амінокислоти пронумеровано відповідно до порядку включення їх до ланцюга.

Еукаріотична 18S рРНК є гомологічною 16S, відрізняючись кількома вставками. У складі 23S рРНК розрізняють шість структурних доменів, але вони тісно взаємодіють один з одним. Порівняно із 16S рРНК, ця структура є значно монолітнішою (рис. 13). Така монолітність зумовлена головною каталітичною функцією великої субодиниці – каталіз не передбачає конформаційної рухливості, а навпаки, вимагає жорсткості просторової організації. Каталітична активність великої субодиниці пов’язана саме з певною зоною у складі 23S рРНК, яка також взаємодіє з акцепторними частинами тРНК. Порівняно невелика 5S рРНКу комплексі з певними рибосомними білками взаємодіє з 23S, формуючи центральний протуберанець.

Рис. 13. Рибосомні РНК у складі маленької (2B9O) і великої (2B9P) субодиниць рибосоми Thermus thermophilus з боку інтерфейсу взаємодії (як на рис. 8). Указано структурні домени рРНК 16S, довга спіральу складі 3′-кінцевого мінорного домену – спіраль 44.

Еукаріотична 5,8S рРНК є гомологічною 5′-кінцевій зоні 23S. Узагалі еукаріотичні 28S і 5,8S рРНК, які утворюють міцний комплекс між собою, – це ніби трохи подовжена за рахунок вставок 23S РНК, розділена на дві нерівні частини. Рибосомні білки розміщуються на поверхні рРНК (відповідно, і на поверхні рибосоми). У складі маленької субодиниці платформа, щілина між платформою та головкою, а також інтерфейс взаємодії з великою субодиницею майже не містять білків, котрі розміщені головним чином на зовнішньому боці субодиниці (рис. 8). По поверхні великої субодиниці білки розподілені рівномірніше, хоча збідненим на них є інтерфейс взаємодії з маленькою субодиницею, і навпаки, палець L7/12 утворений кількома копіями відповідних білків без участі РНК.

Більшість рибосомних білків мають дві частини у своїй структурі: глобулу, розміщену на поверхні рибосоми, і позитивно заряджений хвіст (нерегулярна ділянка, петля або одна–дві окремі α-спіралі), який занурюється в сітку рРНК і стабілізує структуру останньої (рис. 14). У деяких білків глобула відсутня. Отже, усі рибосомні білки (за винятком L7/12) взаємодіють з рРНК, хоча не всі мають високу спорідненість до вільної рРНК. Збирання субодиниць рибосоми з рРНК та білків (може бути здійснено in vitro без участі будь-яких факторів) відбувається поступово, через чотири – пять стадій: зв’язування частини білків на кожній стадії індукує конформаційну зміну рРНК у складі комплексу, що викликає спорідненість до нової порції білків.

Рис. 14. Приклади рибосомних білків у структурі рибосоми (2B9O, 2B9P). Унизу: взаємодія білка L15 з рРНК 23S.

Головна роль рибосомних білків – підтримувати функціонально активну структуру рРНК. Хоча рРНК відповідає за майже всі активності рибосоми, активної конформації вона набуває лише в комплекс із рибосомними білками. Крім того, деякі білки беруть участь у взаємодіях з елементами системи трансляції. Наприклад, білок S1, що міститься поблизу від сайта зв’язування мРНК, сприяє розплітанню дволанцюгових шпильок у складі матриці; комплекс S1–S18–S21 взаємодіє з мРНК, а також ініціаторною тРНК при ініціації трансляції; білок L10 сумісно з певною ділянкою 23S рРНК і білком L11 організує сайт зв’язування G-білків у основі стебла L7/12.

Елонгаційний цикл

Робота рибосоми під час елонгації трансляції полягає в послідовному (потриплетно) зчитуванні інформації з мРНК і відповідному приєднанні амінокислот до поліпептидного ланцюга. Кожен такий крок складається з трьох операцій, що циклічно повторюються (елонгаційний цикл). Цикл розпочинається з такої конфігурації системи, коли в Р-сайті знаходиться пептидил-тРНК, А-сайт є вільним від тРНК і в його межах на маленькій субодиниці розташований черговий кодон, який має бути впізнаним (рис. 15). Перша операція циклу – зв’язування аа-тРНК з А-сайтом. Зв’язування має відбутися з високою специфічністю щодо взаємодій між кодоном і антикодоном – тільки споріднена до даного кодона тРНК має бути відібрана системою. Процес розміщення аа-тРНК в А-сайті часто супроводжується дисоціацією з Е-сайта деаміноацильованої тРНК, яка залишилася там з попереднього циклу. Наслідком зв’язування є належне розташування акцепторних частин аа-тРНК і пептидил-тРНК відносно одна одної та каталітичного активного центру. У результаті рибосома здійснює другу операцію – транспептидацію – перенесення пептидилу з пептидил-тРНК на амінокислоту у складі аа-тРНК. Наслідком є перебудова системи: в А-сайті опиняється пептидил-тРНК із подовженим на одну амінокислоту пептидилом, у Р-сайті – деаміноацильована тРНК. Третя операція транслокація – полягає в переміщенні рибосоми на один кодон уздовж мРНК (молекули тРНК залишаються зв’язаними зі своїми кодонами), після чого розпочинається наступний елонгаційний цикл.

Відбір серед різних молекул аа-тРНК на першому етапі, коли неспоріднені молекули мають швидко звільнятися, а також рух рибосоми при транслокації, передбачають реалізацію певної відкритої, не жорстко зафіксованої, рухливої структурної форми рибосоми. Каталіз транспептидації, навпаки, вимагає жорсткої фіксації субстратіву закритій, жорсткій і нерухливій формі рибосоми. Ефективне вирішення цих суперечливих завдань залежить від полегшення реалізації відкритих форм рибосоми на першому та третьому етапах елонгаційного циклу завдяки двом факторам елонгації (EF – Elongation Factors): EF1 (еукаріотичний аналог позначається як eEF1 або eEF1А, eEF – eukariotic Elongation Factor) і EF2 (еукаріотичний аналог – eEF2). Обидва фактори належать до родини G-білків, або GTP-зв’язувальних білків. Інші білки цієї родини залучені до багатьох різноманітних процесів, зокрема, є елементами асоційованих із мембранами клітинних сигнальних систем.

Рис. 15. Схема елонгаційного циклу.

Елонгаційний фактор EF1

Фактор EF1 (часто також позначається як EFTu) – мономерний білок, що має три структурні домени, – може існувати у двох структурних станах (рис. 16). Співвідношення між вільними енергіями цих станів, а відповідно й імовірність переважної реалізації одного з них, залежить від типу ліганду (GTP чи GDP), що зв’язаний з білком. У комплексі з GDP (гуанозиндифосфат) реалізується відкрита конформація EF1 з порушеними взаємодіями між структурними доменами. Заміна GDP на GTP (гуанозинтрифосфат) приводить до локальної конформаційної перебудови в межах GTP-зв’язувального домену, унаслідок якої певні амінокислотні групи виводяться до інтерфейсу взаємодії з іншими доменами – така взаємодія відбувається і структура замикається. Гідроліз GTP (який здійснюється за певних умов самим білком, див. нижче) проводить до заміни ліганду і, відповідно, до зворотного перемикання конформації. Структурна перебудова EF1 є важливою не сама по собі. GDP і GTP-асоційовані структурні форми мають відповідно низьку та високу спорідненість до аа-тРНК і рибосом: саме у вигляді потрійного комплексу EF1·GTP–аа-тРНК (рис. 17) і відбувається зв’язування аа-тРНК з рибосомою на першому етапі елонгаційного циклу. При цьому вже потрійний комплекс відіграє роль ліганду, що перемикає структурні стани рибосоми.

Рис. 16. Структура фактора EF1 у комплексіз GDP (1TUI) і GTP (1TFT). Зелена кулька – іон Mg²⁺.

Рис. 17. Комплекс EF1·GTP з аа-тРНК (1В23).

Зв’язування EF1·GTP із акцепторною частиною аа-тРНК (рис. 17) відбувається відразу після аміноацилювання тРНК. При завершенні процесу взаємодії з рибосомою (див. нижче) EF1 здійснює гідроліз GTP, що веде до втрати спорідненості та дисоціації EF1·GDP. Після дисоціації молекула GDP витісняється білковим кофактором EFTs (еукаріотичний аналог – eEF1В), який, у свою чергу, замінюється на молекулу GTP, і знову відбувається зв’язування EF1·GТP з новою молекулою аа-тРНК.