Мета роботи: Ознайомлення з методикою приготування поживних середовищ для мікроорганізмів та видами поживних середовищ.
Теоретичні основи: Харчування є важливою функцією мікроорганізмів. Воно необхідне для їх росту і розмноження. У лабораторних умовах мікроорганізми культивують на поживних
середовищах, які повинні мати всі речовини, необхідні для їх росту.
Конструктивні і енергетичні процеси у мікроорганізмів дуже відрізняються.
Тому так само відрізняються їх потреби у поживних речовинах.
Універсальних середовищ, однаково придатних для росту всіх без винятку
мікроорганізмів, не існує. Відомо дуже багато поживних середовищ (ще в
1930 р. було класифіковано більше 2000 середовищ). В той же час число
інгредієнтів, які становлять основу поживних середовищ, невелике.
Основними компонентами будь-якого поживного середовища для
культивування мікроорганізмів є сполуки вуглецю і азоту. Вони і
визначають специфічність більшості поживних середовищ.
Автотрофні мікроорганізми можуть використовувати
вуглекислоту як єдине джерело вуглецю, тому в середовище вносять
гідрокарбонат натрію або продувають повітря, збагачене вуглекислим
газом.
Гетеротрофні мікроорганізми здатні використовувати різні
вуглецевмісні органічні сполуки - кислоти, спирти, вуглеводи, ароматичні
сполуки тощо.
Потреби мікроорганізмів в азоті задовольняються за рахунок
азотовмісних сполук, в яких азот має різний ступінь окислення (амонійні
солі, нітрати, амінокислоти і молекулярний азот, а інколи білки та
пептони).
Багато мікроорганізмів потребує наявності в середовищі так
званих факторів росту (вітамінів, пуринів, піримідинів, амінокислот), які
додають до середовища у вигляді чистих сполук чи у складі дріжджового
або кукурудзяного екстрактів.
Крім джерел вуглецю та азоту і факторів росту для побудови
речовин клітині необхідні сірка, фосфор та інші елементи, а також
мікроелементи. Всі вони повинні входити до складу поживного середовища
у доступній для мікроорганізмів формі. Останнім етапом у приготуванні
поживного середовища є доведення рН розчину до необхідного.
1. Поживні середовища за складом діляться на натуральні, синтетичні та напівсинтетичні.
Натуральні середовища складаються з продуктів рослинного та тваринного походження. Це овочеві або фруктові соки, молоко, картопля або відвари та екстракти, отримані з природних субстратів. Прикладом натуральних середовищ є м'ясо-пептонний бульйон (МПБ) та м'ясо-пептонний агар (ΜΠА), неохмелене пивне сусло, дріжджове середовище, ґрунтова витяжка та інші.
Синтетичні середовища готують з певних хімічно чистих сполук у точно вказаних концентраціях. Переваги синтетичних середовищ полягають у тому, то їх можна точно повторити. Прикладом синтетичних середовищ є середовище Чапека для цвільових грибів та актиноміцетів, середовище Ешбі для азотофіксуючих мікроорганізмів та інші.
Напівсинтетичні середовища поряд зі сполуками відомого складу (вуглеводи, фосфати, нітрати) вміщують у себе речовини невизначеного складу - м'ясний відвар, дріжджовий екстракт.
2. За призначенням середовища поділяють на універсальні та спеціальні.
Універсальні або загальновживані середовища призначені для вирощуваня широкого кола мікроорганізмів. Це МІІА, МПБ.
Спеціальні середовища призначені для виявлення тих чи інших біохімічних особливостей мікроорганізмів або для отримання культур мікроорганізмів, які мають особливі властивості. Серед спеціальних середовищ розрізняють елективні (вибіркові) та диференційно-діагностичні (індикаторні) середовища:
- елективні середовища забезпечують найбільш сприятливі умови для вирощування певних мікроорганізмів. Це середовище Чапека (для цвільових грибів та актиноміцетів), середовище Врублевського, Кітт-Тароцці (для анаеробів), ΜΠΑ з новобіоцином для сапрофітних стафілококів, стійких до новобіоцину, та інші.
- диференційно-діагностичні середовища (індикаторні) дозволяють швидко відрізнити (диференціювати) один вид мікроорганізмів від інших. Часто з цією метою до складу середовища вводять спеціальні барвники-індикатори, які забарвлюють колонії виявлених мікроорганізмів у певний колір.
3. По консистенції середовища поділяються на рідкі, щільні ти сипучі.
Рідкі середовища використовують для вивчення продуктів обміну мікроорганізмів, для виявлення їх фізіолого-біохімічних особливостей, накопичення біомаси.
Щільні середовища використовують для отримання чистої культури мікроорганізмів, для зберігання культур, для визначення ряду властивостей мікроорганізмів.
Щільні поживні середовища готують з рідких шляхом додавання до них агар-агару, желатину, гелю кремнекислого або поліакриламідного гелю.
Сипучі середовища іноді використовують у промисловій мікробіології. До таких середовищ відносять розварене пшоно, висівки, просичені поживним розчином
Готують поживні середовища наступним чином:
1. М'ясо-пептонний бульйон (МПБ). Основою для його
виготовлення служить м'ясна вода, яку готують таким чином: пропущене
через м'ясорубку волове м'ясо, попередньо звільнене від жиру, кісток і
сухожиль заливають подвійним об'ємом водопровідної води та витримують
2-4 год при температурі, близькій до кипіння, або при кімнатній
температурі протягом 13-15 год. Настій кип'ятять 1 год з м'ясом або без
нього, і фільтрують через кілька шарів марлі. До 1 л отриманої м'ясної
води додають 10 г пептону і 1-5 г хлориду натрію, доводять рН до значення
7,0. Для отримання м'ясо-пептонного агару (МПА) до МПБ додають 1,5-
2,0 % агару. МПБ і МПА стерилізують при 1 атм. протягом 20 хв.
2. Солодове (неохмелене) сусло - добре середовище для
культивування молочнокислих і оцтовокислих бактерій, дріжджових,
мікроскопічних грибів та інших гетеротрофних мікроорганізмів.
Пивне сусло готують на пивоварних заводах з ячмінного солоду.
До нього входять вуглеводи (мальтоза, декстрини), азотовмісні сполуки, а
також вітаміни групи В, органічні кислоти і мінеральні солі.
Для усунення білків сусло фільтрують, за допомогою сахариметра
визначають у ньому концентрацію вуглеводів у градусах Балінга (°Б), які
приблизно відповідають відсотковому вмісту цих речовин. Для
культивування дріжджів і грибів використовують сусло з концентрацією 6-
8°Б, для молочнокислих бактерій - 8-12°Б.
Для приготування сусло-агару до сусла додають 1,5-2,0% агару.
Гарячий сусло-агар розливають у колби або пробірки і стерилізують при
0,5 атм. протягом 20-30 хв.
3. Дріжджовий екстракт. 1 кг пресованих дріжджів розводять в
1 л води, кип'ятять протягом 1 год, кілька разів фільтрують і стерилізують
при 0,5 атм протягом 30 хв.
4. Дріжджовий автолізат. Дріжджові автолізати є цінними
стимуляторами росту дріжджів. Вони містять комплекс вітамінів і
ферментів, синтезованих клітиною в процесі росту.
Автоліз в присутності хлориду натрію. Сушені дріжджі (клітинна
оболонка сушених дріжджів більш проникна, що полегшує автоліз)
розмочують у воді у співвідношенні 1:4 і рівномірно перемішують до
однорідної маси, після чого додають НС1 (2,5% відносно до маси сухих
дріжджів) і витримують у термостаті при температурі 48-52°С протягом
12-18 год. По закінченні автолізу рідину кип' ятять протягом 1 год.
Автоліз у присутності суперфосфату. Дріжджі розмішують у
витяжці суперфосфату (1:1) і поміщають у термостат на 48 год при
температурі 45°С. По закінченні автолізу середовище кип'ятять. Витяжку
суперфосфату готують при розведенні однієї частини суперфосфату у двох
частинах води.
5. Комплексний дріжджовий ферментний препарат готують з промитих дріжджів шляхом обробки суспензії концентрацією 6-7% від сухої
речовини на ультразвуковому пастеризаторі з гідравлічним
випромінювачем 35 кГц. За долі секунд досягається відмирання
дріжджових клітин при цьому ферменти зберігають свою активність.
Термін зберігання дріжджового препарату у вигляді пасти до 20
діб при температурі 2-4°С. Комплексний дріжджовий ферментний
препарат слугує біологічним каталізатором біохімічних реакцій і
біостимулятором мікроорганізмів.
6. М’ясо-пептонний агар з новобіоцином.
Приготування антибіотика: 50 мг новобіоцину розчиняють у 10,6 мл етилового спирту (отримується концентрація антибіотика 4 тис. од. / мл), потім до 3 мл цього розчину приливають 9 мл фізіологічного розчину (отримується концентрація 1000 од. / мл). Цю кількість антибіотика (12 мл) вносять у стерильну пляшечку з 200 мл розтопленого та охолодженого до 45 - 50 оС стерильного м'ясо-пептонного агару. Середовище розливають стерильно у чашки Петрі по 20 мл.
7. Диференціально-діагностичне середовище Ендо.
У наш час диференціально-діагностичні середовища випускаються у вигляді сухих порошків. Для приготування цих середовищ 5г порошку всипають у 100 мл холодної дистильованої води, нагрівають при ретельному перемішуванні до повного розчинення агару та кип'ятять 5 хвилин. Гаряче середовище слід фільтрувати через вату та знову довести до кипіння. Середовище охолоджують до 50 оС та розливають у стерильні чашки Петрі. Застигле середовище підсушують у термостаті. У склад сухого середовища Ендо входять: сухий агар, лактоза, фуксин, фосфорнокислий натрій та сульфат натрію.
8. Середовище Гісса.
При вивченні біохімічних властивостей мікробів можна використовувати напіврідкий строкатий ряд, який являє собою набір пοживних середовищ з вуглеводами. Індикатором у таких середовищах служить суміш водного блакитного (барвник) з розоловою кислотою (індикатор ВР).
Середовища готують наступним чином: 2 граму порошку всипають у 100 мл холодної дистильованої води, нагрівають при помішуванні до повного розплавлення агару. Приготовану суміш розливають у пробірки по 5 мл і стерилізують при 0,8 атм. протягом 20 хвилин. Рожево-сірий колір середовища при кислотоутворенні змінюється на синій.
Твердість поживним середовищам надають желатин та агар-агар
Агар - складний полісахарид, якій отримують з морських
водоростей. Він здатний утворювати гелі, які плавляться при температурі приблизно 100°С і стають твердими при 45°С. Агар не розщеплюється під
дією більшості мікроорганізмів. За необхідності його можна
використовувати кілька разів після кількакратного промивання
дистильованою водою і наступного фільтрування.
Желатин - білок, який отримують виварюванням кісток, хрящів,
сухожиль, луски. Желатин плавиться при температурі 25°С, яка нижча за
звичайну температуру інкубації багатьох мікроорганізмів (30-37°С). Ця
властивість желатину обмежує його застосування для ущільнення
середовища. Желатин використовують, головним чином, для виявлення
протеолітичної активності мікроорганізмів. Його додають до рідких
середовищ у кількості 15-20%. Желатинові середовища стерилізують при
0,5 атм 15 хв.
Матеріали, реактиви й устаткування: Стерильні колби з пробками, середовища МПА, ГРМ-1, Ендо, Чапека, Блаурокка.
Хід роботи:
Приготувати та простерилізувати наступні поживні середовища:
1. Середовище Ендо.
2. Середовище ГРМ-1 (за інструкцією на пляшці)
3. Середовище Чапека.
4. Середовище МПА.
5. Середовище Блаурокка.
Контрольні питання:
1. Основні компоненти поживного середовища.
2. Види поживних середовищ.
3. Чому не існує універсальних поживних середовищ для мікроорганізмів?
Форма звітного бланка до лабораторної роботи №6.
| Група | Курс | Лабораторна робота № 6 | ||||||||||||||||||||||||||||
| Приготування поживних середовищ | ||||||||||||||||||||||||||||||
| Прізвище студента | ||||||||||||||||||||||||||||||
1) Заповніть таблицю
2) Відповідь на контрольні питання 3) Висновки по лабораторній роботі №6
| ||||||||||||||||||||||||||||||
| Роботу прийняв | Дата | Підпис | ||||||||||||||||||||||||||||
Лабораторна робота № 7
