Ферментативный анализ представляет собой один из основных аналитических инструментов в международной и отечественной практике научных исследований, современного производственного и сертификационного контроля качества продуктов питания, пищевого сырья и биологических материалов.
Ферментативный анализ является составной частью энзимологии и аналитической химии и служит для специфического определения веществ с помощью высокоочищенных препаратов ферментов.
В основе ферментативного анализа лежат природные биохимические процессы обмена веществ, которые воспроизводятся in vitro: реакция фермента с субстратом, причем в качестве субстрата выступает анализируемое вещество пробы.
Основными преимуществами применения ферментативных методов в научных исследованиях, при разработке новых пищевых технологий и биотехнологических процессов, а также при анализе качества, идентификации и установления фальсификации продуктов питания и пищевого сырья являются:
1. Высокая специфичность и достоверность результатов. Высокоспецифичные ферментативные методы анализа дают, как правило, более достоверные результаты, чем неспецифические химические методы. Специфичность действия ферментов, основанная на комплементарное™ пространственной конфигурации активного центра и субстрата является гарантом достоверности и надежности ферментативного метода при исследовании отдельных соединений в многокомпонентных смесях, имеющих сложный состав и строение, таких, какими и являются пищевые продукты. При разработке ферментативных методов и подборе реагентов, в первую очередь, выбирают ферменты с наибольшей специфичностью действия, для которых подбираются оптимальные условия проведения анализа. Кроме того, при разработке методов ферментативного анализа отдельных компонентов продуктов питания обычно используют несколько ферментов, которые последовательно функционируют в данной системе.
2. Простые способы подготовки проб, которые исключают потерю исследуемых компонентов. Основная задача, которую необходимо выполнить при подготовке пробы, — по возможности наиболее полно сохранить для анализа исследуемый компонент без его количественной потери или изменения структуры. В некоторых случаях возможен прямой анализ пробы без ее предварительной подготовки (например, при абсолютной специфичности фермента к исследуемому веществу и отсутствии в пробе каких-либо мешающих факторов). Обычно же для ферментативного анализа используются простые и хорошо известные способы подготовки проб, такие как: разбавление, фильтрация (центрифугирование), нейтрализация (подкисление), экстракция, обезжиривание, осветление, обесцвечивание. Только в определенных случаях применяют специальные способы подготовки проб, например, при определении водонерастворимых соединений (холестерин, лецитин, крахмал), нестабильной L-аскорбиновой кислоты в твердых материалах и др.
3. Простая и быстрая процедура измерений, которая исключает использование дорогостоящего оборудования. В большинстве ферментативных определений используют фотометрические способы измерения результатов. Для этого все компоненты искусственной тестовой системы, например, буфер, коферменты, активаторы, вспомогательные ферменты и пробу смешивают в фотометрической кювете. После измерения начальной оптической плотности добавляют стартовый фермент, который инициирует реакцию. В конце реакции (через определенный промежуток времени) повторно измеряют оптическую плотность тестовой системы. Из разницы оптических плотностей в начале и в конце реакции по уравнению закона Ламберта — Бера рассчитывают концентрацию С (г/л) искомого соединения.
C =
| [(E 2 - E 1) опыт - (E 2 - E 1) контроль] ∙V∙M∙F |
| ε∙d∙v∙ 10000 |
где (E 2 - E 1) опыт — разница конечной и начальной оптической плотности в кювете с пробой; (E 2 - E 1) контроль— разница конечной и начальной оптической плотности в кювете без пробы; V — общий объем реакционной смеси, мл; М — молярная масса искомого соединения, г/моль; F — фактор разведения пробы; ε — молярный коэффициент экстинкции (например, кофермента НАДФ/НАД при λ = 340 нм, ε = 6,3 л/ммоль ∙ см); d — толщина кюветы, см; v — объем пробы, добавляемый в кювету, мл.
В большинстве ферментативных методов прямому фотометрическому контролю доступно измерение таких вспомогательных компонентов тестовой системы, как коферментов НАД+/ПАДН или НАДФ+/НАДФН. Количество восстановленных или окисленных коферментов прямопропорционально количеству искомого соединения. Система конечных значений с фотометрическим измерением результата настолько надежна, что служит в качестве стандарта для оценки других методик. Для проведения ферментативного анализа используется стандартное оборудование, которое имеется практически в любой производственной лаборатории: спектрофотометры или фотометры с интервалом измерений от 325 до 800 нм; кюветы для фотометрических измерений, мерные пипетки и дозаторы, весы, центрифуга, рН-метр, водяной термостат, фильтры и т. п.
Таблица 8.5. Применение ферментативных методов для анализа различных компонентов пищевых продуктов [А. Ю. Колесное. Ферментативный анализ в пищевой промышленности, 1996. № 11]
| Группа продуктов | Анализируемые компоненты |
| Детское питание, диетические продукты | Сахароза, D-глкжоза, D-фруктоза, лактоза, мальтоза, крахмал, L-аскорбиновая кислота, лимонная кислота, D-, L-молочные кислоты, D-сорбит, ксилит, лецитин, холин |
| Пиво, вино, игристые вина | D-глюкоза, D-фруктоза, сахароза, глюкозный сироп, этанол, глицерин, D-сорбит, сульфит, нитраты, L-, D-молочные кислоты, D-глкжоновая кислота, уксусная кислота, лимонная кислота, янтарная кислота, L-аскорбиновая кислота |
| Хлеб, хлебобулочные изделия, шоколад, мороженое и конд. изделия | Сахароза, D-глкжоза, D-фруктоза, лактоза, мальтоза, крахмал, этанол, глицерин, D-сорбит, ксилит, холестерин, лецитин |
| Яйца и яичные продукты | Янтарная кислота, L- молочная кислота, D-3-гидроксимасляная кислота, холестерин |
| Соки, фруктовые продукты, безалкогольные напитки | Сахароза, D-глкжоза, D-фруктоза, лимонная кислота, D-изолимонная кислота, L-аскорбиновая кислота, D-, L-молочные кислоты, этанол, уксусная кислота, глюкозный сироп, щавелевая кислота, глицерин, D-, L-яблочные кислоты, муравьиная кислота, D-глюконовая кислота, D-сорбит, нитраты |
| Мясо и мясные продукты | Сахароза, лактоза, D-глюкоза, D-галактоза, крахмал, лимонная кислота, уксусная кислота, D-глюконовая кислота, L-глутаминовая кислота, D-, L-молочные кислоты, муравьиная кислота, глицерин, аммиак (мочевина), креатин/ креатинин, пирофосфаты, холестерин |
| Молоко и молочные продукты | Лактоза, D-глюкоза, D-галактоза, D-фруктоза, крахмал, сахароза, лимонная кислота, уксусная кислота, L-яблочная кислота, янтарная кислота, L-глутаминовая кислота, D-, L-молочные кислоты, этанол, ацетальдегид, триглицериды, мочевина, нитраты |
| Пищеконцентраты (например, супы) | Сахар и сахаристые изделия |
| Креатин, L-глутаминовая кислота, сахароза, крахмал | Сахароза, D-глюкоза, D-фруктоза, раффиноза, муравьиная кислота, лимонная кислота, D-, L-молочные кислоты, D-сорбит, этанол |
4. Высокая чувствительность метода и хорошая воспроизводимость результатов. Высокая чувствительность позволяет использовать ферментативные методы для определения следовых количеств веществ. Например, в продуктах питания могут быть определены следующие концентрации компонентов (г/л): этанол — 0,001; ацетоальдегид — 0,001; лимонная кислота — 0,002; глицерин — 0,001; D-глюкоза — 0,002; D-сорбит — 0,001; лактоза — 0,005; нитраты — 0,001.
Кроме вышеперечисленных достоинств ферментативных методов анализа можно назвать и универсальность применения, высокую надежность и устойчивость к мешающим факторам, низкие затраты на проведение анализа (время, оборудование, расходуемые материалы), а также использование безопасных реактивов.
Области применения ферментативного анализа на практике многообразны. Это и производственный контроль, и контроль качества готовой продукции, а также контроль сырья, анализ состава пищевого продукта с целью установления их свойств и соответствия законодательным нормам, оценка гигиенического статуса, идентификация и установление фальсификации.
В табл. 8.5 приведены некоторые группы продуктов питания, а также их компоненты, для анализа которых разработаны специфические ферментативные методы.
По словам одного из основоположников ферментативного анализа Г. Бергмана: " Ферментативный анализ, как принцип, свободен от недостатков и ошибок, т. к. он представляет систему для измерений, которую успешно использует живая клетка уже в течение миллионов лет".
Контрольные вопросы
1. Каковы химическая природа и особенности ферментов как биологических катализаторов?
2. Что изучает кинетика ферментативных реакций?
3. Как влияет концентрация субстрата и фермента на скорость ферментативной реакции?
4. Как определяются основные кинетические параметры ферментативной реакции: V0; Vmax; Ks; Km? Почему именно V0 (начальная скорость) является мерой количества фермента?
5. Что такое ферментные препараты и каково их отличие от ферментов?
6. Какие ферменты наиболее широко применяются в пищевой промышленности?
7. По каким критериям оцениваются ферментные препараты с точки зрения их использования в той или иной пищевой технологии?
8. В чем заключаются особенности подхода при характеристике ферментов пищевого сырья и исследовании поведения ферментов (ферментных препаратов) в режиме определенной пищевой технологии?
9. Что такое иммобилизованные ферменты?
10. Каковы основные области применения ферментативного анализа на практике? Перечислите основные преимущества ферментативных методов исследования пищевых продуктов.
