Этот метод конфокальной микроскопии был изобретен сравнительно недавно, около 15 лет назад благодаря работам немецких физиков Хелла, Стелзера и др. Идея метода состоит в следующем. Как известно, разрешающая способность микроскопа зависит прежде всего от длины волны света и числовой апертуры объектива: NA = n sin α. Показатель преломления иммерсионной среды n ~ 1.5, sin α ≤1, поэтому теоретически NA ≤ 1.5. Сейчас созданы объективы с NA = 1.45, т.е. достигнут конструктивный предел. Поэтому изобретатели решили применить два объектива, расположенные на одной оси, но с противоположных сторон препарата! Поскольку теоретически угол захвата света двумя объективами может составлять при этом 4p, микроскоп получил название 4-пи.
С помощью системы зеркал и призм возбуждающий свет делится на два потока и направляется в объективы, фокусы которых совпадают (рис. 3). Меняя длину одного из плеч такого интерферометра, можно добиться того, чтобы фазы двух световых волн в области фокуса также совпадали. Образуется стоячая волна, при этом происходит значительное сужение функции PSF в аксиальном направлении (теоретически в 4-7 раз!), т.е. повышается аксиальная разрешающая способность (см. рис. 5.12).
Рис. 5.12 Оптическая схема 4-пи приставки к ЛСКМ. (LEICA Microsystems).
Существует три варианта 4-пи конфокальной микроскопии:
А) Освещение прпарата производится через два объектива, а детекция сигнала – через один.
В) Освещение производится через один объектив, а детекция – через два.
С) Освещение и детекция производится через два объектива.
Такой микроскоп сейчас серийно выпускается фирмой Лейка.
Рис.5.13 Функция PSF для различных вариантов 4-пи конфокальной
микроскопии (пояснения в тексте).
STED микроскопия
Как уже указывалось, STED расшифровывается как stimulation emission depletion, т.е. «обеднение (уровней) при стимулированной эмиссии». Этот метод появился всего несколько лет назад. Если бы сообщения о нем не были опубликованы в солидных журналах и не принадлежали изобретателю 4-пи конфокальной микроскопии (S.Hell), можно было бы воспринять это как шутку: “Diffraction resolution limit broken!».
Идея метода вроде бы проста, однако не все специалисты согласны с его теоретическим обоснованием. Для реализации метода STED в конфокальном микроскопе используются 2 лазера: 1) для возбуждения спонтанной (обычной) флуоресценции; 2) с длиной волны больше, чем максимум флуоресценции, причем форма пятна в виде полой сферы в области фокуса создается с помощью специальной схемы (рис.5). По краям этой сферы происходит стимулированная эмиссия (как в лазере) на длине волны стимулирующего лазера и обеднение энергетических уровней возбужденных атомов.
Рис. 5.14 STED-приставка к конфокальному микроскопу SP5 (Leica
Microsystems).
Флуоресценция (спонтанная) происходит только из центральной области фокуса, при этом функция PSF становится более узкой, т.е. латеральное разрешение улучшается. В сочетании с 4-пи микроскопией это дает возможность повысить как латеральную, так и аксиальную разрешающую способность до величины 90-100 нм.
Перспективы развития ЛСКМ
Конфокальная микроскопия постоянно развивается. Фирмы- производители создают новые более совершенные приборы. Вот только небольшой перечень инноваций за последние несколько лет. В 2002 году фирма Leica анонсировала акустооптический светоделитель (AOBS), позволяющий эффективно разделять лазерный луч возбуждения и люминесценцию. Светоделитель управляется от компьютера, и его спектральные свойства могут быстро перестраиваться, в том числе, на несколько лазерных линий. В этом же году фирма Carl Zeiss начала выпускать конфокальный микроскоп LSM 510 META с оригинальным фотоприемником, который позволяет регистрировать сигнал одновременно в 32-х спектральных каналах. В 2004 году Zeiss создает высокоскоростной LSM 5 Live, имеющий скорость сканирования в 20 раз выше обычного конфокального микроскопа. Фирма Olympus разработала прибор с двумя сканерами, работающими одновременно и позволяющими более эффективно применять, например, методику FRAP. Nikon идет другим путем – создает компактный и недорогой конфокальный микроскоп упрощенной конструкции. И наконец, фирма Leica в 2007 г. объявила о серийном выпуске STED - конфокального микроскопа. Таким образом, время от изобретения новых устройств до серийного выпуска ЛСКМ постоянно сокращается.
ЛЕКЦИЯ № 12
