Большинство современных ЛСКМ могут работать в мультиспектральном режиме, при котором можно получить изображение одного и того же объекта, окрашенного несколькими красителями в разных спектральных областях. Параметры этих областей определяются составом лазерного блока, количеством и параметрами фотоприемных каналов. Типичным и наиболее распространенным использованием мультиспектрального режима работы ЛСКМ является исследование колокализации в клетке двух и более веществ, например,разных белков. Предварительно вещества или структуры метятся антителами с разными флуоресцентными метками. Такое изучение помогает понять, существует ли причинно-следственная связь между этими веществами В случае существенной толщины объекта в обычный микроскоп трудно разобрать, находятся ли вещества рядом или одно под другим. Для этих целей на ЛСКМ необходимо одновременно использовать и режим получения серий оптических срезов, чтобы воссоздать объемное распределение веществ.
Количественным критерием степени колокализации двух веществ может служить т.н. цветовая двумерная гистограмма, на которой по двум координатам отложены интенсивности каждого из каналов для каждой точки изображения.
Таким образом, при полной колокализации и при совпадении интенсивностей меток все точки гистограммы будут лежать на прямой под углом 450.
Рис. 5.6. Спектры разных областей изображения клетки, полученные в режиме спектрального сканирования на LEICA TCS SL.
Еще один вариант спектральных исследований на ЛСКМ - это исследование спектров испускания клеток и их компартментов, как живых так ификсированных. Эти исследования возможны не на всех ЛСКМ, а только на тех, где фотоприемный блок построен по принципу спектрофотометра. К таким приборам относятся ЛСКМ LEICA TCS SP5, SPE, SL, а также LSM 510 META. К мультиспектральным исследованиям на ЛСКМ можно отнести и цитогенетический метод FISH – Fluorescence in-situ hubridisation, т.е. выявление специфических последовательностей ДНК или хромосом с использованием флуоресцентных зондов.
Динамические процессы
Изменения, происходящие в клетках и их структурах во времени, можно исследовать и на обычных микроскопах, снабженных видеосистемой. Но ЛСКМ позволяет получать серии изображений с высоким пространственным разрешением, особенно в аксиальном направлении. Кроме того, благодаря наличию лазеров и системы сканирования можно осуществлять не только регистрацию временных изменений, но и осуществлять воздействие на клеточные структуры лазерным излучением.
Быстродействие ЛСКМ определяется в основном сканирующей системой колеблется от единиц до нескольких десятков тысяч кадров в секунду. Частота кадров во многом определяется размерами кадра (т.е. числом точек сканирования – пикселов). Чем меньше размер кадра, тем большую скорость можно получить.
Характерные применения в области биологии – это т.н. трассирование, т.е. прослеживание в живых организмах или клетках распространения каких- либо веществ. Для этого вещества должны обладать либо собственной флуоресценцией, либо их необходимо метить флуоресцентными зондами. Например, можно исследовать потоки ионов Са++ через клеточные мембраны использованием красителей типа FURA или FLUO, чувствительных к концентрации ионов.
FRAP
Fluorescence Recovery After Photobleaching (Восстановление флуоресценции после фотовыжигания). Этот метод можно также отнести к исследованию динамических процессов. Метод применяется для измерения подвижности молекул посредством инициации фотохимического разложения флуорохрома в зоне облучения.
Рис. 5.7. FRAP, FLIP, фотоактивация (LeicaMicrosystems).
После выжигания молекулы с флуорохромом из необлученной зоны движутся посредством диффузии в облученную зону образца. По времени нарастания в ней флуоресценции можно судить о подвижности молекул (рис. 5.7а, 3). Существуют также и другие методы исследования подвижности молекул, например, FLAP - Fluorescence Localization After Photobleaching (Локализация флуоресценции после фотовыжигания), FLIP - Fluorescence Loss In Photobleaching (Потеря флуоресценции во время фотовыжигания), фотоактивация молекул (см. рис. 5.7).
Процесс фотовыжигания и регистрации изменения интенсивности флуоресценции записывается в виде серии изображений, с помощью которых строится график (рис. 5.8). После учета различных факторов (например, фона) аппроксимации кривой, вычисляется время «полувосстановления»
флуоресценции t1/2, на основании которого определяется коэффициентьдиффузии молекул:
D = 0.88*w2 /(4 t1/2)
где w– радиус выжженной области. Эта формула приближенная, т.к. описывает процесс диффузии только в латеральной плоскости.
Рис. 5.8. FRAP. ROI1- облученная, ROI2-необлученная область (LEICA TCS SL)
FRET
Főrster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer - Фёрстеровская (флуоресцентная) резонансная передача энергии. Этот метод применяется для определения малых расстояний между молекулами, их окружения и взаимодействия. Метод очень чувствительный и значительно превосходит разрешающую способность обычной световой микроскопии, однако работает на весьма ограниченных расстояниях (несколько нм). Молекулы метятся двумя флуорохромами со спектром испускания донора, перекрывающимся со спектром поглощения акцептора. Энергия от донора к акцептору передается на малых расстояниях в результате резонанса между энергетическими уровнями, вероятность процесса, следовательно, и интенсивность излучения зависит от расстояния между молекулами. Затем акцептор излучает энергию в видимой области спектра, которая регистрируется конфокальным микроскопом.
Эффективность FRET зависит от расстояния r между донором и акцептором:
E ~ 1/ (1 + (r/R)6)
где R – константа (~ 3 нм).
Рис. 5.9 Схема энергетических уровней донора и акцептора при FRET.
Существует несколько процедур проведения FRET: Acceptor photobleaching, Donor photobleaching, Ratio imaging, Sensitized emission, которые учитывают различные поправки, например собственную флуоресценцию донора и акцеп.
