Конфокальная микроскопия - это один из методов световой микроскопии, а конфокальный микроскоп - оптический прибор, поэтому на него распространяется ряд ограничений, присущий таким приборам, например, дифракционные эффекты, зависящие от длины волны излучения. Один из недостатков обычного светового микроскопа - внефокусные лучи, которые снижают контраст изображения (рис.5.1а). Если в оптическую схему микроскопа ввести специальную диафрагму, расположенную в плоскости промежуточного изображения, то она пропустит только те световые лучи, которые исходят из очень небольшой области объекта (рис. 5.16). Диафрагма будет играть роль пространственного фильтра. Чем меньше диаметр диафрагмы, тем меньше размеры этой области.
в
Рисунок 5.1 - Пространственная фильтрация световых лучей с помощью конфокальной диафрагмы
Однако в этом случае мы получим изображение только одного элементарного объема, причем необязательно освещать весь объект, достаточно освещение именно этого объема (рисунок 5.1в). Полное изображение объекта в конфокальном микроскопе формируется при последовательном просмотре этих элементарных объемов с применением различных сканирующих систем. Накопление информации происходит либо благодаря свойству инерционности зрения при быстром сканировании, либо посредством использования фотоприемников и электронных запоминающих устройств. Таким образом, конфокальная микроскопия обеспечивает увеличение контраста изображения за счет фильтрации внефокусных лучей.
Для того, чтобы регистрировать свет только от одной точки после объективной линзы располагается диафрагма малого размера таким образом, что свет, испускаемый точкой фокальной плоскости (рисунок 5.2), проходит через диафрагму и будет зарегистрирован, а свет от точек перед и за фокальной плоскостью в основном задерживается диафрагмой и ослабляется в десятки раз. Вторая особенность, повышающая контрастность изображения, расположенного в фокальной плоскости, состоит в том, что осветитель создает не равномерную освещенность поля зрения, а фокусирует свет в анализируемую точку. Это может достигаться расположением второй фокусирующей системы за образцом, но при этом требуется, чтобы образец был прозрачным. Кроме того, объективные линзы обычно сравнительно дорогие, поэтому использование второй фокусирующей системы для подсветки мало предпочтительно. Альтернативой является использование светоделительной пластинки, так чтобы и падающий и отраженный свет фокусировались одним объективом (рисунок 5.2). Такая схема к тому же облегчает юстировку, а полноценное изображение строится путем сканирования (движения образца или перестройки оптической системы).
Рисунок 5.2 – Принцип конфокальной микроскопии
Рассмотрим теперь математически, каким образом и насколько количественно изменяется контрастность при применении конфокальной микроскопии. Во-первых, так как в конфокальном микроскопе свет дважды проходит через объектив, то функция размытия точки (далее обозначаемая PSF, см. определение в предыдущем пункте) имеет вид
(1)
Для качественного понимания удобно рассматривать каждую PSF как вероятность того, что фотон попадет в точку с координатами, либо что фотон будет зарегистрирован из точки с координатами, тогда конфокальная PSF есть произведение независимых вероятностей. На рисунке 3 приведено изображение обычной PSF и конфокальной PSF.
Рисунок 5.3 - Конфокальная PSF показана справа, а обычная PSF – слева
Если использовать критерий Релея для разрешения (провал 26% от максимума распределения), то мы получим, что разрешение в конфокальном микроскопе увеличивается, но не существенно. Для конфокального микроскопа
(1)
в то время как для обычного микроскопа
(2),
где.
Однако основным достоинством конфокального микроскопа является не увеличение разрешения в смысле критерия Релея, а существенное увеличение контрастности. В частности для обычной PSF в фокальной плоскости отношение амплитуды в первом боковом максимуме к амплитуде в центре составляет 2%, для случая конфокального микроскопа это отношение будет 0.04%. На рисунке 5.4 приведен практический пример, когда это важно. На верхней части рисунка мы видим, что тусклый объект (интенсивность в 200 раз меньше, чем у яркого) невозможно обнаружить в обычный микроскоп, хотя расстояние между объектами существенно больше того, что предписано критерием Релея. В то же самое время, в конфокальный микроскоп (нижняя часть рисунка 5.3) данный объект должен хорошо регистрироваться.
Рисунок 5.4 - Распределение интенсивности для случая обычного микроскопа (вверху) и конфокального микроскопа (внизу). Максимум интенсивности тусклого объекта в 200 раз меньше, чем интенсивность яркого
В результате такая система обладает хорошим разрешением в направлении оптической оси и путём смещения объекта относительно фокальной плоскости позволяет сканировать послойно объект, платой при этом является необходимость применения достаточно сложных схем сканирования либо образцом, либо световым пучком. Преимущество такой системы очевидно, так как нет необходимости разрезать объект на слои и фиксировать их, а это всегда ведёт к разрушению клеток объекта и изменению их характеристик.
Конфокальная микроскопия обеспечивает увеличение контраста изображения за счет применения сфокусированной подсветки в области анализа и диафрагмирования излучения в плоскости наблюдения. Такое увеличение контрастности приводит к возможности разрешения объектов, имеющих разницу в интенсивности до 200:1, а также обеспечивает повышение разрешения, как в плоскости объекта, так и вдоль оптической оси. Наряду с повышением контрастности флуоресцентная конфокальная микроскопия позволяет обеспечивать покомпонентную трехмерную реконструкцию исследуемого объекта за счет использования многочастотной подсветки.
Среди наиболее передовых методик сканирующей конфокальной микроскопии следует выделить использование сканирующего диска с микродиафрагмами (рисунок 5.5).
Рисунок 5.5 - Сканирующего диска с микродиафрагмами
Таким образом, современный ЛСКМ имеет следующие основные узлы:микроскоп, сканирующий блок, осветительный блок (лазеры), компьютер соспециальным программным обеспечением.
Основными преимуществами конфокальной микроскопии по сравнению собычной световой микроскопией являются:
1. Высокая контрастность изображения.
2. Улучшенная разрешающая способность (латеральная в 1.4 раза, аксиальная - в зависимости от размера конфокальной диафрагмы).
3. Получение «оптических срезов», трехмерная реконструкция.
4. Мультиспектральные исследования с высокой степенью разделения сигналов от разных флуорохромов.
5. Возможности применения методов цифровой обработки изображений.
К недостаткам конфокальной микроскопии можно отнести:
1. Сложность настройки прибора.
2. Отсутствие в ЛСКМ «оптического» изображения. Оно существует только в цифровой форме и отображается на экране монитора.
3. Высокая стоимость оборудования и его эксплуатации.
