Органопрепараты для инъекций представляют собой стерильные, очищенные от балластных веществ экстракты из животного сырья (питуитрин, витогепат) и препараты, изготовленные на основе индивидуальных биологически активных веществ (гормонов, ферментов). Процесс изготовления органопрепаратов для инъекций па первых стадиях протекает так же, как и изготовление препаратов для внутреннего употребления. Экстракцию подготовленного сырья проводят, как правило, методами мацерации, используя растворители; водные растворы кислот, этанол, ацетон со строго определенными значениями рН и др., обеспечивающие максимально возможный выход биологически активных веществ. При разработке схем производства этой группы препаратов особое внимание уделяют подбору оптимальных параметров процесса (значение рН среды, температурный режим, продолжительность цикла, правильный подбор оборудования и др.}.
Особенностью технологии парентеральных органопрепаратов является глубокая, максимальная очистка экстрактов от балластных веществ. Для освобождения от жира водные экстракты обрабатывают органическими растворителями (бензин, эфир и др.). Иногда жиры из водного экстракта удаляются в виде застывшей на поверхности корки после продолжительного отстаивания на холоду. Грубая очистка, позволяющая освободиться от основной массы балластных белков, достигается отстаиванием извлечений при охлаждении, высаливанием, термофракционированием, кислотно-щелочной обработкой (фракционирование). Освобождение извлечений от низкомолекулярных биологических примесей и веществ, используемых при грубой очистке (соли, кислоты, щелочи, органические жидкости), осуществляется диализом или электродиализом и ультрафильтрацией. При выделении индивидуальных биологически активных веществ (гормоны, ферменты) широко используют различные методы хроматографии: ионообменную, адсорбционную, гель-хроматографию (проникающую), афинную (лигандную).
Очищенные активные вещества растворяют в соответствующем растворителе и подвергают биологическому и химическому анализу. В связи с тем что большинство гормонов и ферментов термолабильны и не способны выдерживать тепловую стерилизацию, их стерилизуют фильтрованием через мембранные фильтры. Поскольку водные растворы ряда гормонов и ферментов быстро инактивируются при хранении, их разливают во флаконы или ампулы и подвергают лиофильной сушке. Затем ампулы запаивают, а флаконы герметически закрывают резиновыми пробками с последующей металлической обкаткой, что позволяет проколом пробки иглой шприца ввести во флакон растворитель и отобрать нужное количество раствора, не нарушая стерильности.
ПРЕПАРАТЫ ГОРМОНОВ
Гормоны - это вещества, образующиеся в железистых клетках эндокринных желез, выделяющиеся в кровь или лимфу и регулирующие обмен веществ и развитие организма. Гормонам присущи общие биологические признаки: высокая активность, строгая специфичность действия и его дистанционность, т. е. способность регулировать обмен и функции клеток на расстоянии. По химическому строению они относятся к следующим группам: вещества белкового и полипептидного строения (гормоны гипофиза, паращитовидной и поджелудочной желез; кальцитонин щитовидной железы), производные аминокислот (тироксин и трийодтнронин щитовидной железы), стероидные соединения (гормоны коры надпочечников и половых желез).
Препараты стероидных гормонов, производных аминокислот и пептидов (окситоцин, вазопрессин) получают путем химического синтеза. В настоящее время синтезированы инсулин и некоторые белковые гормоны гипофиза (кортикотропин, соматотропин) и т. д. Однако химический синтез полипептидных гормонов, состоящих из десятков аминокислотных остатков, многостадиен, дает малый выход и нерентабелен.
Интенсивно развивающиеся физико-химическое и генетическое направления в биологии позволили создать новые технологии веществ белковой природы. Методами генной инженерии получены штаммы - продуценты пептидных гормонов: инсулина, соматотро-пина, кальцитонина и др. В отличие от химического синтеза получение гормонов методом биосинтеза является экономически более эффективным, так как не требует использования катализаторов, высоких температур, давления и т. д. В то же время использование биотехнологии позволяет получать гормональные препараты, абсолютно идентичные гормонам человека и не являющиеся чужеродными, в отличие от аналогичных, выделяемых из организма животных. Некоторые из них, например инсулин и соматотропин человека, разрешены к использованию в медицинской практике.
Однако препараты полипептидных гормонов в основном получают из дорогого и дефицитного сырья.
Препарат гормонов щитовидной железы. Тиреоидин (Thyreoidinum) -высушенная, обезжиренная и измельченная в порошок щитовидная железа крупного рогатого скота и свиней. Получают по общей схеме производства сухих органопрепаратов: измельчение железы, высушивание, обезжиривание, удаление остатков органического растворителя и измельчение полученной массы. Действие тиреоидина обусловлено наличием гормонов: тироксина и трнйодтиронина. Препарат стандартизуют по содержанию органически связанного йода, которого должно быть 0,17-0,23%.
Тиреоидин - мелкий аморфный порошок желто-серого цвета, со слабьш запахом, характерным для высушенных животных тканей. Выпускают в виде порошка и таблеток, покрытых оболочкой, по 0,05 и 0,1 г. Хранят по списку Б, в сухом, прохладном, защищенном от света месте. Препарат назначают внутрь при недостаточной функции щитовидной железы и в более высоких дозах - при избыточнй тирсо-тропной функции гипофиза.
Препараты гормонов задней доли гипофиза. Адиурекрин или сухой питуитрин (Adiurecrinum seu Pituilrinum siccum) - высушенные, обезжиренные и измельченные в порошок задние доли гипофиза рогатого скота и свиней. Препарат получают по общей схеме изготовления сухих органопрепаратов. Гипофиз отделяют и консервируют в ацетоне, Перед производством вынимают из ацетона, отделяют заднюю долю, разрезают ее на 3-4 части и сушат в вакуум-сушильном шкафу при температуре не выше 40°С. Сухой материал обрабатывают эфиром в аппарате «Сокслета» до полного обезжиривания. Остаток экстрагента удаляют высушиванием под вакуумом. Высушенные, обезжиренные задние доли гипофиза превращают в порошок в шаровой мельнице.
Препарат содержит гормоны задней доли гипофиза: аптидиуретический (вазопрессин) и окситоцин. Активность адиурекрпна определяют биологическим методом по способности повышать артериальное давление у крыс; 1 мг содержит 1 ЕД.
Адиурекрин представляет собой аморфный порошок серого цвета с желтоватым оттенком и специфическим запахом. Выпускают в стеклянных флаконах no 1; 5 и 10 г. Хранят по списку Б, в прохладном месте. Применяют в качестве антидиуретического средства при несахарном мочеизнурении и ночном недержании мочи. Порошок вводят в полость носа при легком вдыхании. -Действие наступает через 15-20 мин, продолжается 6-8 ч.
Питуитрин для инъекций (Pituitnnum pro injcctionibus) - экстракт задней доли гипофиза крупного рогатого скота и свиней, очищенный от балластных белков. Препарат получают путем экстракции измельченных задних долей гипофиза водой, подкисленной кислотой хлороводородной до значения рН 2,5, при температуре +40 ° С в течение 1 ч. К экстракту добавляют 20% раствор натрия гидрооксида до значения рН 4,8-5,5 для осаждения балластных белков. Надосадочную жидкость нагревают до кипения для полного удаления белков и фильтруют. В фильтрате устанавливают значение рН 3,0-4,0, в качестве консерванта добавляют 0,25-0.3% фенола, стерилизуют фильтрованием и разливают в ампулы.
Питуитрин - прозрачная бесцветная жидкость кислой реакции. Действующими веществами являются окситоцин и вазопрессин. Стандартизуют биологическим методом: по способности вызывать сокращение изолированного рога матки морской свинки, 1 мл должен содержать 5 ЕД. Выпускают в ампулах по 1 мл. Хранят по списку Б, в защищенном от света месте, при температуре от + 1 до + 10°С. Применяют для возбуждения и усиления сократительной деятельности матки.
Препараты гормонов передней доли гипофиза.
Для медицинских целей из передней доли гипофиза животных выделяют адренокортнкотропный (АКТГ), лактогенный и тиреотропный гормоны.
Один из способов промышленного производства гормонов из гипофиза свиней, разработанный во ВНИИ технологии кровезаменителей и гормональных препаратов (ВНИИТКГП), предусматривает комплексное использование исходного сырья и последовательное выделение отдельных гормонов передней доли гипофиза. В основу способа положена однократная экстракция гормонов из измельченных тканей передних долей гипофиза свиней подкисленным водным S0% ацетоном. Кислый водно-ацетоновый экстракт отделяют центрифугированием. Жмых собирают и используют для получения тиреотропного гормона для медицинской практики, а также соматотропного, фоликулостимулирующего и лютенизирующего гормонов, применяемых в ветеринарии. Экстракт, отделенный центрифугированием, содержит АКТГ и лактогенный гормон, которые осаждают ацетоном, повышая его концентрацию в смеси до 92%, и отстаиванием па холоду при температуре - 2-5°С в течение 10-12 ч. Осадок - кислый ацетонированный порошок (КАП) отделяют, промывают на нутч-фильтре охлажденным 98% ацетоном и высушивают на воздухе до полного его удаления. КАП растворяют в воде, подкисленной кислотой уксусной, и, добавляя раствор аммиака, доводят до значения рН 5,0. В изоэлектри-ческой точке осаждается лактогенный гормон. Осадок отделяют центрифугированием и используют для получения препарата - лактина.
Раствор после отделения лактогенного гормона разбавляют аммонийно-ацетатным буфером (рН 5,0) и пропускают через колонку, заполненную катионитом КМ-сефадекс К-25. По окончании процесса сорбции кортикотропина на ионообменной смоле проводят его десорбцию этанольньш раствором аммонийно-ацетатного буфера. Из элюата АКТ Г осаждают этанолом. Осадок отделяют центрифугированием, промывают этанолом, ацетоном и высушивают на воздухе. Стандартизуют АКТГ биологическим методом, активность выражают в единицах действия (ЕД). Для приготовления лекарственных форм используют субстанцию АКГТ активностью 70-90 ЕД/мг.
Кортикотропин для инъекции (Corti-cotropinum pro injectionibus) - порошок АКТГ с содержанием 70-90 ЕД/мг растворяют в воде, имеющей значение рН 3,0-5,0 и температуру 5°С. Раствор фильтруют через стерилизующие фильтры, разливают во флаконы и подвергают сублимационной сушке. Стерильный лиофилизированный порошок выпускают в герметически укупоренных флаконах, содержащих 10-20-30-40 ЕД кортикотропина. Хранят по списку Б, в защищенном от света месте, при температуре не выше 20°С. Применяют кортикотропин в основном при вторичной гипофункции коркового вещества надпочечников и при ревматизме, бронхиальной астме, разных аллергических и других заболеваниях. Кортикотропин оказывает кратковременное действие. Для получения лечебного эффекта его необходимо вводить несколько раз в сутки.
Суспензия цинк-кортикотропина (Sirs-pensio Zinc-corticotropini) - препарат пролонгированного действия. Суспензия - стерильная, белого цвета, содержит 20 ЕД кортикотропина в 1 мл, цинка хлорид, глицерин,- консервант (0,25% фенола), значение рН 7,0-8,0. Выпускают во флаконах по 5 мл. Вводят внутримышечно по 10, 20 или 40 ЕД (0,5; 1,0 или 2,0 мл) 1 раз в сутки. Лечебный эффект начинается через 8-10 ч и длится более 24 ч. Хранят по списку Б, при температуре от 1 до 10°С. Не допускается замораживание.
Лактин для инъекций (Lactinum pro injectionibus) - стерильный лиофилизированный порошок белого цвета. Для получения препарата лакто-генный гормон растворяют в воде для инъекций, фильтруют через стерилизующие фильтры, разливают во флаконы и подвергают сублимационной сушке. Выпускают в герметически укупоренных флаконах вместимостью 5 мл, содержащих по 100 или 200 ЕД. Хранят в сухом, защищенном от света месте, при температуре от 15 до 20°С. Применяют для стимуляции лактации в послеродовом периоде.
Тиротропин для инъекций (Thyrotropi-num pro injectionibus) -■ стерильный лиофилизированный порошок светло-желтого цвета. Выпускают в герметически укупоренных флаконах вместимостью 5 мл, содержащих по 10 ЕД. Хранят в сухом, прохладном, защищенном от света месте, при температуре не выше 10°С. Применяют для диагностики гипотиреоза и как лечебное средство при недостаточности щитовидной железы.
Препараты гормона поджелудочной железы. Инсулин (Insulinum) -гормон поджелудочной железы, продуцируется в р-клетках, находящихся в ткани островков Лаигерганса. Инсулин является белком с молекулярной массой около 6000, имеющим 51 аминокислоту и две цепи: А, состоящую из 21, и В - из 30 аминокислот, соединенных дисульфидными мостиками.
Сырьем для получения инсулина является поджелудочная железа рогатого скота и свиней. Ввиду наличия в поджелудочной железе фермента трипсина получение инсулина долгое время оставалось безрезультатным. В 1921 г. канадские исследователи Ф. Г. Беитинг и Ч. X. Бест впервые выделили инсулин из поджелудочной железы при обработке ее подкисленным крепким этанолом. При этом ферменты инакги-вируются и теряют способность разрушать инсулин. В настоящее время известно несколько технологий выделения инсулина, которые отличаются друг от друга лишь в деталях. Свежие или замороженные ткани железы измельчают на мясорубке-волчке и экстрагируют способом бисмацерации в эмалированном реакторе с мешалкой. В качестве экстрагента для первой мацерации используют 80-85% этанол, для второй - 57% этанол, подкисленный кислотой ортофосфорной (серной, хлороводородной) до значения рН 2,8-3,0. Экстракцию проводят 1,5-4 ч при перемешивании. Экстракты отделяют фильтрованием или центрифугированием, объединяют и проводят очистку.
Предварительная, грубая очистка экстракта одинакова по всем технологиям, она сводится к удалению анионов кислот. Так, анион кислоты ортофосфорной (РО4»3) удаляют раствором кальция хлорида при значении рН 3,3-3,8. Затем осуществляют депро-теинизацию - последовательное отделение балластных белковых веществ при значении рН 4,5-5,1 и 3,5 при температуре О°С. Выпадающие осадки отделяют центрифугированием. Прозрачный экстракт концентрируют выпариванием на вакуум-дистилляционной установке пленочного типа при температуре не выше 30°С до содержания этанола 10-25% в возможно более короткий срок, при строгом соблюдении температурного режима, так как длительное нагревание приводит к инактивации инсулина. Концентрированный остаток очищают от липидов и балластных белков отстаиванием на холоду (0-4°С) при значении рН 3,0-3,3. От всплывшего слоя липидов и осадка балластных белков экстракт отделяют фильтрованием. Из сгущенного, очищенного экстракта инсулин-сырец выделяют двукратным высаливанием 25% раствором натрия хлорида или 40% раствором аммония сульфата. Этот способ используется на некоторых заводах с 1928 г. по настоящее время.
Наиболее прогрессивным является способ выделения инсулина ионообменной хроматографией, разработанный и внедренный в 1970 г. на Минском заводе медпрепаратов. По этому способу операцию упаривания исключают, а осуществляют сорбцию инсулина из экстракта, частично освобожденного от балластных белков, на отечественном макропористом сульфо-катионите КУ-ЗЗ-30/IOO при значении рН 3,0 -3,3 в режиме псевдоожижения. Для удаления жира катионит промывают 65-67% этанолом, а для отдо леиия балластных белков--0,3 М раствором ацетатного буфера (рН 5,3). Десорбцию инсулина проводят 0.01-0,05 М раствором аммонийного буфера (рН 9,8-10,0). Инсулин неустойчив в щелочной среде, поэтому десорбируют его быстро, элюат немедленно подкисляют кислотой хлороводородной до значения рН 4,1-4,5 и добавляют ацетон. Осадок балластных веществ удаляют. Инсулин осаждают в виде цинк-инсулина раствором цинка ацетата (рН 6,1-6,2), очищают кристаллизацией. Цинк-инсулин растворяют в воде, подкисленной кислотой лимонной до значения рН 2,6-2,8. Раствор отстаивают в течение 1 ч и выпавший осадок балластных белков удаляют фильтрованием через кизельгур. Фильтрат смешивают с ацетоном, добавляют цинк хлористый и фенол, охлаждают до температуры 0°С, создавая условия для медленной кристаллизации инсулина. Раствор подщелачивают до значения рН 8,0-8,5; оставляют на 2-3 мин, затем создают значение рН 6,7-6,8 и перемешивают 1 ч; при значении рН 6,5 перемешивают 2 ч; при значении рН 6,2 и 6,0 перемешивают 2 ч и отстаивают 18-20 ч и при значении рН 5,8 перемешивают 2 ч и отстаивают 48-96 ч при температуре 5°С. Выпавшие кристаллы инсулина отделяют центрифугированием, промывают на воронке Бюхнера ледяной водой дистиллированной, ацетоном и эфиром. Досушивают инсулин на воздухе, в вытяжном шкафу и эксикаторе.
Активность инсулина определяют биологическим путем: по способности понижать содержание сахара в крови у здоровых кроликов. За единицу действия принимают активность 0,04082 мг кристаллического инсулина (стандарта), она должна быть 24-26 ЕД в 1 мг.
Препараты кристаллического инсулина. Инсулин для инъекций (Insulinum pro injectionibus) получают растворением кристаллического инсулина с активностью 24-26 ЕД/мг в воде, подкисленной кислотой хлороводородной до значения рН 3,0-3,5. К раствору добавляют солюбилизатор (1,6-1,8% глицерина) и консервант (0,25-0,3% фенола). Раствор стерилизуют фильтрованием через стерилизующие фильтры.
Суиисулин (Suinsulinum) - раствор кристаллического инсулина, получаемого из поджелудочной железы свиней, в ацетатном буфере. Раствор имеет значение рН 7,0-7,5, содержит консервант - нипагин.
Инсулин для инъекций и суинсулин применяют при лечении диабета, вводят под кожу или внутримышечно. В случаях необходимости неотложной помощи больному, например при диабетической коме, вводят внутривенно. Действие препаратов при введении под кожу или внутримышечно развивается через 15-20 мин и продолжается около 6 ч. Суинсулин реже вызывает аллергические реакции, применяется при осложнениях после инъекций инсулина, полученного из поджелудочной железы крупного рогатого скота, и при резистентности к инсулину.
Недостатком растворов инсулина является непродолжительность действия, поэтому выпускают ряд пролонгированных препаратов.
Суспензия и исулин-протамина для инъекций {Suspensio insulin-protamini pro injection i b u s) - первый препарат инсулина продленного действия, получен смешиванием раствора кристаллического инсулина с протамином сульфата (белок из молоки осетровых рыб). При контакте с тканями инсулин постепенно отделяется от протамина и снижает содержание сахара в крови. Эффект наступает через 2-4 ч, достигает максимума через 8-12 ч и продолжается 16-18 ч.
IIротамин-цинк-инсулин для инъекции (Protamin-zinc-insulinum pro injectionibus) получают при добавлении небольшого количества цинка хлорида к инсулин-протамину, что еще больше пролонгирует действие последнего. Эффект препарата наступает через 3-6 ч после инъекций, достигает максимума через 14-20 ч и продолжается 24-36 ч. Препарат представляет собой стерильную суспеи зпго белого цвета, в фосфатном буфере, значение рИ 6,9-7,3, консервант - фенол (0,25-0,3%).
Определенный успех в нисулннотерошш вызван появлением трех инсулииов пролонгированного действия-суспензий цинк-инсулн^а. Их получают смешиванием стерильных растворов кристаллического инсулина с цинка хлоридом и буферным раствором. Изменяя порядок смешивания и длительность перемешивания, можно осадить две физические фракции цинк-инсулина: аморфную и кристаллическую Суспензию аморфного цинк-инсулина (величина частш; не превышает 2 мкм) получают при кратковременном перемешивании растворов, суспензию кристаллического- при медленном перемешивании (30-40 об/мин) в течение 18-20 ч. При этом формируются кристаллы ромбовидной формы величиной 10-40 мкм. Суспензии цинк-инсулина стабильны при нейтральном значении рН. Состав препаратов на 100 ЕД инсулина, мг: натрия аиетата - 3,4; натрия хлорида - 17,5; цинка хлорида - 0,20; значение рН 7,1-7,5; фенола - 0,25-0,3%. Введенные подкожно суспензии цинк-инсулина постепенно всасываются и вызывают снижение сахара в крови, продолжительность которого зависит от физического состояния цинк-инсулина.
Суспензия цинк-инсулина аморфного для инъекций (Suspensio Zinc-insulini amorphi pro injectionibus) проявляет быстрое действие - через 1 - 1,5 ч, но оно сравнительно короткое - длительностью 10-12 ч.
Суспензия цинк-инсулина кристаллического для инъекций (Suspensio Zinc-insulini crystallisatt pro injectionibus - препарат наиболее длительного действия, снижение сахара в крови наступает через 6-8 ч, достигает максимума через 16- 20 ч и продолжается 30-36 ч.
Суспензия цинк-инсулина для инъекций (Suspensio Zinc-insulini pro injectionibus) - препарат со средней продолжительностью действия. Его получают смешиванием суспензий цинк-инсулина аморфного и кристаллического в отношении 3:7. Снижение сахара в крови при введении под кожу наступает через 2-4 ч, умеренно усиливается к 5-7 ч, достигает максимума через 8-10 ч и продолжается 20-24 ч. Этот препарат позволяет многим больным обходиться одной инъекцией в сутки.
Препараты инсулина выпускают во флаконах вместимостью 5 или 10 мл, укупоренных резиновыми пробками с последующей металлической обкаткой. Активность инсулина 40 и 80 ЕД в 1 мл. Хранят по списку Б, в защищенном от света месте, при температуре от 1 до 10°С. Замораживание не допускается.
Инсулин М и его препараты. В 1983 г. в ВНИИТК.ГП разработана технология инсулина М, не содержащего проинсулина и балластных белков, определяющих способность препаратов повышать иммунные реакции организма. Дополнительная очистка кристаллического инсулина осуществлена ионообменной хроматографией на макропористом анионите отечественного производства АВ-171-40/100 и повторной перекристаллизацией.
Кристаллический инсулин растворяют в 40% этаноле с добавлением динатриевой соли этилендиамин-тетрауксусной кислоты, связывающей ионы цинка и таким образом повышающей его растворимость. Концентрированный раствор инсулина центрифугируют и сорбируют на анионите АВ-171-40/100. Элюируют инсулин раствором аммонийного буфера, содержащим 40% этанола, натрия хлорид, значение рН 7,4-7,6. Собирают фракции элюата, содержащие хроматогра-фически чистый инсулин. Кристаллизуют инсулин из цитратного буфера, содержащего цинка хлорид и 20% этанола, при значении рН 6,9 и 5,8. Получают высо-коочищенный инсулин с активностью не ниже 26 ЕД/мг.
На основе суинсулина М, полученного из поджелудочной железы свиней, созданы высокоочищенные препараты, аналогичные препаратам кристаллического инсулина, но характеризующиеся низкой антигенной активностью. Раствор суинсулина М (Suinsulinum М) в ацетатном буфере в отличие от раствора кристаллического инсулина имеет не кислую, а нейтральную реакцию, значение рН 7,0-7,5. Препараты продленного действия - суспензии: цинк-инсулина М аморфного для инъекций или инсулйн-семилонг (Insulin semilong), цинк-инсулина кристаллического для инъекций или инсулин-ультралонг (Insulin ultralong) и цинк-инсулина М для инъекций или инсулин лонг (Insulin long).
ПРЕПАРАТЫ ФЕРМЕНТОВ
Ферменты - биологические катализаторы белковой природы, содержащиеся во всех клетках живых организмов. Они катализируют биохимические реакции, которые без них протекали бы с неизмеримо малой скоростью.
Важнейшими свойствами ферментов являются эффективность катализа (позволяют увеличивать скорость реакций в 1010-10'2 раз) и исключительная избирательность действия (каждый фермент катализирует, как правило, одну химическую реакцию). Как и все белки, ферменты являются высокомолекулярными соединениями, с молекулярной массой от 10 000 до 1000 000. Ферментные белки, обладая малостойкой структурой, весьма чувствительны к изменениям значения рН и температуры. Для каждого фермента существует оптимум значения рН, при котором скорость катализируемой реакции максимальна. Так, активность трипсина имеет оптимум при значении рН 7,8; панкреатической амилазы - при 6,4-7,2. Отклонение значения рН в ту пли иную сторону ведет к снижению скорости ферментативной реакции. Фер-ментыь оптимальное действие которых находится в нейтральной или щелочной средах, полностью ипакти-вируются кислым содержимым желудка.
Оптимальное значение температуры для большинства ферментов - 20-40°С. Повышение температуры до 40-50°С, как правило, приводит к падению ферментативной активности, а иногда и к полной денатурации ферментов.
При производстве упзнмных препаратов наряду с применением высокоэффективных научно обоснованных способов получения особенно необходима высокая культура производства, строгое соблюдение режимов технологии. Большое внимание уделяется стабилизации ферментов как на стадии получения субстанции, так и в лекарственной форме. В настоящее время используют три основных приема стабилизации: защита лабильных центров ферментов, ответственных за их активность, химической модификацией (в том числе иммобилизацией); защита от воздействия инактивирующих факторов нанесением оболочки и введением в субстанцию или лекарственную форму добавок, ипгнбирующих деструкцию ферментов.
Источником получения ферментов являются органы ч ткани животных, решительное сырье и ферменты, продуцируемые микроорганизмами. Основное количество ферментных препаратов медицинского назначения получают из органов и тканей животных. Из ферментов растительного происхождения в нашей стране для медицинских целей предложен к использованию только одни препарат: липаза из семян чернушки дамасской (Nigella Damascena L.J. Все шире используются в медицинской практике ферменты, получаемые из культур микроорганизмов, преимуществом которых являются более высокая доступность и экопо мичноегь их производства.
Препараты ферментов слизистой оболочки желудка. Пепсин (Pepsinum) - препарат, содержащий протеолитический фермент. Сырьем для получения пепсина служит слизистая оболочка желудка свиней, где он образуется в виде профермента - пепсиноге-на. Пепсиноген активируется кислотой хлороводородной и аутокаталитически, г. е. с помощью образовавшихся молекул пепсина. При этом от пепсиногена (м.м. 40000) сначала отщепляется остаточный полипептид, а затем ингибитор пепсина. Образуется активный пепсин (м.м. 34 000). Пепсин относится к карбо-протеиназам, содержащим остатки аминокислот ди-карбоповых в активном центре, с оптимумом значения рН 1,5-2,5.
При выделении протеолитического фермента основной задачей является получение (с высоким выходом) его в активной форме. Поэтому экстракцию сочетают с автолизом. Измельченные ткани заливают водой, подкисленной кислотой хлороводородной до значения рН 1,9-2,3. Соотношение сырья и экстрагента 10:1. Настаивание проводят при температуре около 40°С, перемешивая на протяжении 8 ч и повторно в течение 24 ч. Лизаты сливают, отделяют от верхнего слоя жира, объединяют, процеживают. Ферментную массу выделяют высаливанием, для чего к лизату (значение рН 1,9-2,3) при непрерывном перемешивании добавляют 20-25% раствор натрия хлорида. Пепсин, выделившийся из раствора, всплывает на поверхность. Его отделяют, сушат в вакуум-сушильном шкафу при температуре 35-40°С, измельчают в фарфоровой шаровой мельнице и просеивают.
Стандартизуют препарат по протеолитической активности (переваривание белка куриного яйца): 10 г протертого белка в присутствии 0,1 г препарата в стандартных условиях должны полностью раствориться через 3-4 ч, образуя опалесцирующий раствор. После определения биологической активности препарат смешивают с сахарной пудрой. Он представляет собой слегка желтоватый порошок, сладкого вкуса со слабым своеобразным запахом. Хранят в хорошо укупоренных банках в прохладном (2-15°С), защищенном от света месте. Применяют при расстройствах пищеварения (гипо- и анацидный гастрит, ахилия, диспепсия). Назначают внутрь в виде раствора в комбинации с ацидином (бетаина гидрохлорид).
Ацидин-пепсин (Acidin-pepsinuvn) выпускают в таблетках по 0,5 и 0,25 г, содержащих I часть пепсина и 4 части бетаина гидрохлорида. При введении в желудок бетаина гидрохлорид легко гидролизуется с выделением свободной кислоты хлороводородной.
Абомин (Abominum) - препарат, содержащий сумму протеолитических ферментов, получают из слизистой оболочки желудка телят и ягнят молочного возраста. Он представляет собой аморфный порошок со специфическим запахом, соленого вкуса (содержит примесь натрия хлорида). Выпускают в форме таблеток по 0,2 г, с содержанием в 1 таблетке 50 000 ЕД.
Сок желудочный натуральный (Succus gastricus naturalis) получают по методу, предложенному И. П. Павловым, через фистулу желудка при мнимом кормлении собак или других животных (лошадей). Препарат представляет собой прозрачную бесцветную жидкость кислого вкуса, консервированную кислотой салициловой (0,03-0,04%). Он содержит все ферменты желудочного сока, 0,45-0,51% свободной кислоты хлороводородной, значение рН 0,8-1,2. Выпускают во флаконах по 100 мл. Хранят в защищенном от света месте, при температуре от 2 до 10°С. Применяют при недостаточной функции желез желудка.
Препарат ферментов поджелудочной железы. Панкреатин (Pancreatinum) - препарат содержит ферменты поджелудочной железы, главным образом трипсин и амилазу и в незначительном количестве липазу. Сырьем для получения панкреатина служит поджелудочная железа свиней или рогатого скота.
В поджелудочной железе протеолитические ферменты образуются в виде проферментов: трнпсино-гена, химотрипсиногена. Активирование этих ферментов происходит гидролизом того фрагмента их полипептидной цепи, который маскирует активный центр протеиназ. При получении панкреатина активирование проферментов поджелудочной железы осуществляют в экстракте в щелочной среде, в присутствии ионов кальция и с затравкой (панкреатин).
Ткани поджелудочной железы убойных животных измельчают на волчках и заливают водой, подкисленной кислотой уксусной - ледяной 5 мл на 1 л воды. Настаивание проводят в реакторе с мешалкой в течение 4 ч при температуре 10°С. Экстракт отделяюг центрифугированием или процеживанием с последующим прессованием остатка. Для активирования проферментов в экстракте создают среду со значением рН 8,1; добавляют кальция хлорид, чтобы приготовить 0,05 М раствор, и затравку - панкреатин. Настаивают 24 ч при температуре 5°С. Затем экстракт подкисляют до значения рН 6,0, и в изоэлектри-ческой точке осаждают балластные белки. Осадок отделяют, обезжиривают ацетоном и высушивают в вакуум-сушильном шкафу при температуре не выше 40 СС. Измельчают в фарфоровой мельнице.
Стандартизуют панкреатин по протеолитической активности - способности переваривать белок казеин в слабощелочной среде. Панкреатин должен содержать в 1 г 25-33 ЕД. Препарат выпускают в порошке и таблетках, покрытых оболочками, растворимыми в кишечнике. Хранят в хорошо закупоренных банках, в сухом, прохладном месте. Применяют при хронических панкреатитах с недостаточной функцией поджелудочной железы.
Технология ферментных препаратов из поджелудочной железы крупного рогатого скота: дезоксири-бонуклеазы (ДНКаза), рибонуклеазы (РНКаза), трипсина, химотрнпсина, ингибитора протеаз - пан-трипина и инсулина - разработана лабораторией органопрепаратов Всесоюзного научно-исследовательского института мясной промышленности. Принцип производства заключается в том, что измельченную поджелудочную железу подвергают автолизу, для чего смешивают ее с половинным количеством воды и оставляют на 18 ч при температуре 12°С. Затем в реакторе с мешалкой проводят экстракцию методом бнс-мацерации водой, подкисленной кислотой ортофос-форной до значения рН 2,0-*-2,5, при температуре не выше 5°С. Первая мацерация проводится с двойным количеством воды в течение 16 ч, вторая - с однократным 1 ч. Экстракты отделяют от жмыха центрифугированием и объединяют. Жмых используют для получения инсулина, а из экстракта высаливают ферменты различными концентрациями аммония сульфата (ДНКазу и РНКазу], добавляя кристаллический аммония сульфат до определенной степени насыщения при перемешивании и охлаждении. Фильтрат используют для получения химотрипсина, трипсина и пачтрипина.
Высол растворяют в воде (1:4) и в водном растворе осаждают балластные вещества добавлением аммония сульфата. Осадок отбрасывают, а к фильтрату добавляют 5 и. раствор натрия гидроксида до значения рН 4,5 и высаливают ДНКазу, медленно добавляя насыщенный раствор аммония сульфата до степени насыщения 0,4. Осадок ДНКазы отделяют и подвергают дальнейшей очистке. Из фильтрата осаждают РНКазу высаливанием аммония сульфатом до степени насыщения 0,8. Высол, содержащий аморфную РНКазу, отстаивают при 4-5°С в течение 40- 48 ч, жидкость сифонируют, а осадок отделяют на нутч-фильтре или центрифугированием. Полученную РНКазу очищают. Из фильтрата, содержащего комплекс ферментов, аммония сульфатом при степени насыщения 0,7 высаливают химотрипсин, трипсин и пан-трипин.
Из смеси ферментов получают неактивный химо-трипсиноген. Для этого осадок растворяют в воде, подкисленной кислотой серной до значения рН 3,0, при температуре не выше 5°С и медленно добавляют при перемешивании раствор аммония сульфата. Затем раствор подщелачивают 5 и. раствором натрия гидроксида до значения рН 5,0 и выдерживают при комнатной температуре до полного осаждения кристаллического химотрипсиногеиа.
Из фильтрата и промывных вод, полученных после отделения химотрипсиногеиа, выделяют трипсиноген высаливанием аммония сульфатом при лодкислении 5 н. кислотой серной до значения рН 3,0.
Фильтрат, оставшийся после выделения трипсина, подкисляют кислотой хлороводородной до значения рН 2,5 при температуре 5°С. Из подкисленного фильтрата добавлением кристаллического магния сульфата высаливают пантрипин совместно с балластными белками. Последние удаляют коагуляцией при нагревании раствора до температуры 90°С в течение I мин и быстром охлаждении до температуры 20- 25°С. Осадок балластных веществ отделяют фильтрованием. К фильтрату, объединенному с промывными водами, медленно при перемешивании добавляют кристаллический аммония сульфат и отстаивают в течение 12 ч при комнатной температуре. В результате образуется два осадка: аморфный и кристаллический. Темный аморфный осадок пантрипина отделяют от белого кристаллического осадка балластных веществ. Осадок пантрипина растворяют в воде и диализируют. По окончании диализа раствор фильтруют, стандартизуют по сухому остатку и силе ингибирующего действия пантрипина. Проводят стерилизующую фильтрацию, разливают во флаконы и подвергают сублимационной сушке.
Очистка индивидуальных ферментов продолжается несколько дней и состоит из ряда многократно повторяющихся операций.
Проводят 3-кратное высаливание ферментов аммония сульфатом до различной степени насыщения, изменяя значения рН. Каждый раз из фильтрата предварительно удаляют балластные вещества осаждением аммония сульфатом меньшей концентрации, чем применяемая при высаливании ферментов, затем осуществляют 5-кратную перекристаллизацию ферментов. Химотрипсиноген и трипсиноген активируют до образования химогрипсина и трипсина в соответствующих буферных растворах при пониженной температуре при добавлении кристаллика трипсина. Обессоливают ферменты диализом через целлофановую пленку. Сульфат-ионы осаждают бария хлоридом, а избыток иона бария удаляют на катионите КУ-2. В обессоленных растворах ферментов устанавливают необходимое значение рН, определяют концентрацию сухого вещества и разбавляют водой дистиллированной в соответствии с конечным содержанием сухого препарата во флаконах. Разбавленные растворы фильтруют через стерилизующие фильтры, разливают во флаконы и подвергают сублимационной сушке.
Дезоксирибонуклеаза (Desoxyribonucle-asa) представляет собой лиофилизированный белый порошок, легко растворимый в воде; значение рН 0,1% водного раствора составляет 3,0-5,5. В водных растворах фермент нестоек (срок годности 12 ч), термолабилен, инактивируется при температуре 55 йС. Активность определяют по образованию кислоторас-творимых продуктов, освобождаемых препаратом из ДНК в определенных условиях, и выражают в единицах активности (ЕА). В (мг препарата должно содержаться не менее 1700 ЕА. Выпускают в герметически укупоренных флаконах по 5, 10, 25 и 50 мг.
Хранят в сухом, защищенном от света месте, при температуре не выше 20°С. Применяется как средство, вызывающее деполимеризацию и разжижение гноя и задерживающее развитие вирусов, содержащих ДНК (герпеса, аденовирусов и др.). Назначают в виде аэрозолей для ингаляций.
Рибонуклеаза аморфная (Ribonucleasum amorphum) - лиофилизированный порошок белого цвета, растворимый в воде. Активность определяют биологическим методом по количеству кислоторас-творимых веществ, освобождаемых препаратом в результате гидролиза кислоты рибонуклеиновой в определенных условиях. 1 ЕА соответствует 1 мг препарата. Выпускают в герметически укупоренных флаконах по 10, 25, 50 мг. Хранят в сухом, защищенном от света месте, при температуре не выше 15°С. Применяют местно в виде аэрозолей для ингаляций, внут-риплеврально, внутримышечно при заболеваниях, сопровождающихся гнойно-некротическими процессами.
Химотрипсин кристаллический (Chy-motrypsinum crystallisatum) представляет собой блестящие чешуйки или порошок белого цвета, легко растворимый в воде, значение рН 0,2% водного раствора составляет 4,5-6,5. Водные растворы быстро инак-тивируются. Выпускают в герметически укупоренных флаконах, содержащих по 5 и 10 мг кристаллического химотрипсина. Хранят в прохладном (не выше 10°С), защищенном от света месте. Применяют как рибо-нуклеазу.
Трипсин кристаллический (Tr^psinum crystallisatum) представляет собой пористую массу или порошок белого цвета, легко растворимый в воде, значение рН 0,2% водного раствора составляет 3,0- 3,5. В нейтральных и щелочных растворах препарат быстро разрушается. Выпускают в герметически укупоренных флаконах или в ампулах по 5 и 10 мг. Хранят в сухом, защищенном от света месте, при температуре не выше 10°С. Применяют как химотрипсин.
Пантрипин (Pantrypinum) - ингибитор про-теаз (трипсина, химотрипсина и др.), представляет собой лиофилизированный порошок желтоватого цвета, хорошо растворимый в воде. Стандартизуют биологическим путем по способности понижать активность трипсина. В 1 г препарата содержится не мепсе 650 ЕД. Выпускают в герметически укупоренных флаконах по 6, 12, 15, 20 и 30 ЕД. Хранят в сухом, защищенном от света месте, при температуре не выше 20°С. Применяют при панкреатитах, вводят внутривенно.
Препараты ферментов из семенников.
Роиидаза (Ronidasum) - препарат, содержащий фермент гиалуронидазу, получают из семенников половозрелого крупного рогатого скота. Семенники обрабатывают 2% раствором фенола в течение 5-15 мин, тщательно промывают водой, снимают оболочку и измельчают на волчке. Измельченные семенники заливают физиологическим раствором, содержащим 0,25% хлороформа в соотношении 1,0:0,5, и экстрагируют ро-нидазу при перемешивании в течение 35-40 мин. Экстракт отделяют фильтрованием, осадок отжимают под гидравлическим прессом, отжатую жидкость присоединяют к экстракту, разливают по кассетам из нержавеющей стали, сушат методом сублимации. Высушенный препарат измельчают в шаровой мельнице, расфасовывают в стеклянные флаконы по 5 и 10 г, герметически укупоривают. Хранят в защищенном от света месте при комнатной температуре. Применяют наружно при лечении рубцов (ожоговых, послеоперационных), контрактур суставов.
Лидаза (Lydasum) -препарат гиалуронидазо-вого действия. Для получения лидазы измельченные семенники крупного рогатого скота обрабатывают 0,1 н. раствором кислоты уксусной в отношении 1:2 при температуре 10°С и перемешивании в течение 4 ч. Надосадочиую жидкость отделяют if ацетоном осаждают фермент гиалуронидазу. Осадок растворяют в воде и процесс осаждения ацетоном повторяют три раза. Освобожденный от ацетона осадок очищенной гиалуронидазы растворяют в воде, фильтруют через стерилизующие фильтры, разливают во флаконы и высушивают методом сублимации. Выпускают во флаконах, содержащих по 64 УЕ (условные единицы) стерильного сухого вещества. Хранят в сухом, темном месте, при температуре не выше 15°С. Основными показаниями к применению лидазы являются контрактуры суставов, рубцы после ожогов и операций, анкилозирующий слондилоартрит, гематомы и др. Раствор вводят под кожу.
