Зберігання і використання замороженої сперми

Місце проведення заняття: лабораторія технології відтворення сільськогосподарських тварин.

Оснащення робочого місця: Зморожена сперма бугая, барана, дистильована вода, аптечні терези з наважками, необхідні реактиви: натрію цитрат, мензурки, змішувачі, бактеріологічні чашки, шприци, пеніцилінові флакони, гумові корки для них, марлеві серветки, спиртові тампони, паперові фільтри; пінцети, термометри, мікроскопи, обігрівальні столики, предметні та накривні скельця, термоси, водяна баня, електроплитка, таз з теплою водою, градуйовані піпетки, термоси різних конструкцій, пластмасові круглі коробки для складання ампул, вата сіра, лід, посудини Дьюара, гумові рукавиці, спеціальні обладнання для розрідження сперми.

Зберігання та використання замороженої сперми. Короткі методичні вказівки. Після попереднього ознайомлення з методами зберігання сперми різних видів сільськогосподарських тварин студенти формують підгрупи по 3-5 чоловік і самостійно оцінюють сперму, розріджують її відповідно до отриманого завдання, розфасовують і виконують усі технологічні прийоми, передбачені методикою зберігання сперми. Сперму, поставлену на короткочасне зберігання, студенти оцінюють за рухливість сперміїв протягом зберігання, а глибокозаморожену - щотижня і роблять відповідні записи в зошиті.

Попередні зауваження. Штучне осіменіння сільськогосподарських тварин проводять нині переважно спермою що зберігається, тому одним з головних завдань племпідприємств і пунктів штучного осіменіння має бути забезпечення високого виживання та запліднювальної здатності сперміїв з моменту еякуляції і аж до введення їх у статеві шляхи самки. Для цього насамперед необхідно сповільнити обмін речовин у спермі, знизити температуру її зберігання або додати до неї речовини, що гальмують рухливість сперміїв.

Застосовують короткочасне (при температурі 2-4°С або при кімнатній температурі) і довготривале зберігання сперми у глибоко замороженому вигляді. Нині практично всі пункти штучного осіменіння сільськогосподарських тварин користуються останнім методом.

В охолодженій до 2-4°С спермі обмінні процеси сповільнюються, знижується нагромадження токсичних продуктів обміну речовин, різко зменшується використання на енергетичні цілі пластичних речовин протоплазми, що викликає у сперміїв стан анабіозу і збільшує їх живучість.

При зберіганні сперми в умовах кімнатної температури у ній гальмуються обмінні процеси наявними у розріджувачі слабкими кислотами чи хелатоном.

У глибокозамороженій спермі настає глибокий анабіоз сперміїв з майже повним припиненням обмінних процесів. Методи зберігання сперми в замороженому вигляді передбачають захист сперміїв від температурного шоку при охолодженні до 0°С і від кристалізації внутрішньоклітинної рідини в процесі заморожування.

У замороженій до мінус 196°С спермі всі обмінні процеси знижуються до рівня підтримки живучості сперміїв у нерухомому стані, і вона може зберігатися безмежно довго.

Необхідними умовами зберігання сперми є її висока якість, розрідження та суворе дотримання температурного режиму.

Зберігання сперми бугая, барана, кнура та жеребця при плюс 2-4°С. Охолодження розрідженої сперми до плюс 2-4°С викликає у сперміїв стан анабіозу, проте за надто раптового зниження температури навіть з 38°С до 12-18°С у них виникає температурний шок (холодовий удар) з незворотною втратою рухливості.

Сперму бугая охолоджують до температури плюс 2-4°С поступово, протягом 2-3 год. Для цього скляну мензурку з розрідженою спермою бугая ставлять спочатку в посуд з теплою водою (30°С), потім переносять на 20 хв. в інший посуд з температурою 22°С і лише після цього розфасовують при кімнатній температурі в чисті і стерильні флакони з-під антибіотиків, одноразові стерильні скляні чи поліетиленові ампули, поліетиленові пробірки об'ємом 1 мл.

Розливають розріджену сперму у флакони з-під антибіотиків майже до самої шийки, закривають гумовими корками, підклавши під них аркушики парафінованого паперу, й закріплюють гумовими кільцями.

Для розфасовування сперми бугая в поліетиленові ампули виймають з пакета стерильну поліетиленову ампулу, надрізають її верх, стискають її двома пальцями і занурюють шийку ампули в мензурку з розрідженою спермою. Розтискають пальці і, коли ампула наповниться спермою, запаюють її отвір, притуляючи шийкою до нагрітої праски через фторопластову плівку. Складають наповнені спермою ампули в пластмасові коробки з покришками і залишають їх при кімнатній температурі на 20-30 хв.

Для розфасовування розрідженої сперми бугая у скляні ампули наливають її в чисту суху стерильну чашку пневматичного фасувального апарата. Потім беруть комплект чистих сухих скляних стерильних ампул, занурюють їх шийками у сперму, накривають чашку покришкою і вміщують її у гніздо апарата. Натискують кнопку вмикача і ампули заповнюються спермою. Запаюють кінці ампул на не кіптявому полум'ї апарата Флетчера. Вміщують їх у спеціальні коробки (чи поліетиленові мішечки) і кладуть у термос на шар вати над льодом. Розфасовану сперму ставлять на 10 хв. у кювету з водопровідною водою, після чого переносять на полицю холодильника, де температура підтримується у межах плюс 2-5°С.

Сперму барана, розфасовану в ампули, пробірки чи флакони, витримують протягом 10-15 хв. при кімнатній температурі, потім обгортають їх шаром вати або вміщують у поролонові амортизатори, а потім – у поліетиленові чи гумові пакети, герметичне закривають і поступово охолоджують до плюс 2-5°С в побутовому холодильнику чи харчовому термосі з льодом, підстеливши під пакети із спермою шар вати, який через 3-4 год. виймають, а пакети із спермою ставлять безпосередньо на лід.

Зберігання сперми кнура при температурі 16-20°С. Взяту на штучну вагіну й оцінену сперму кнура розріджують середовищами ГХЦС чи ГХЦ, визначають у ній активність сперміїв, розливають у скляні колби чи поліетиленові флакони, накривають їх негерметично поліетиленовою плівкою, вмішують у невелику картонну коробку і зберігають в затемненому місці при температурі 16...20°С.

Для зберігання сперми при дещо нижчих температурах (не нижче 6°С) її розріджують середовищами ГХЦСЖ або ГХЦЖ. Транспортують розріджену сперму в термосах, термос-скриньках, побутових сумках-холодильниках при температурі 16-20°С, закривши щільно колби зі спермою.

На пункті штучного осіменіння сперму зберігають у негерметично закритих колбах. Не менше одного разу на добу її легенько змішують. Термін використання такої сперми (при рухливості сперміїв не нижче 6 балів) – до 3-х діб.

Методи заморожування сперми бугая. Заморожування спермій бугая у вигляді гранул над парою рідкого азоту на фторопластовій пластинці.

Для заморожування використовують сперму, попередньо оцінену (з концентрацією сперміїв не менше 0,7 млрд в 1 мл та рухливістю їх не нижче 8 балів) й розріджену у 2 або 10 разів лактозо-жовтково-гліцериновим середовищем і витриману 4-6 годин в холодильнику.

Сперму низьких ступенів розрідження застосовують для виготовлення концентрованих гранул по 0,1-0,2 мл, які потребують додаткового розрідження на пунктах штучного осіменіння, а великі - для виготовлення гранул об'ємом 0,5-1 мл, що не потребують додаткового розрідження.

Рідкий азот наливають у ванну з пінопластового блока, в яку вставлено емальовану металеву кювету. Опускають фторопластову пластинку на 1 хв в рідкий азот (до припинення кипіння азоту), виймають її, закріплюють її на ви соті 2-3 см над поверхнею рідкого азоту.

Розріджену і витриману протягом 4-6 год при 5°С сперму набирають у стерильний холодний 2-мілілітровий пластмасовий шприц з голкою для взяття крові чи в спеціальну крапельницю і швидко накапують у кожну з малих ямок пластинки по 0,1-0,2 мл сперми, а у великі ямки – по 0,5-1 мл.

Витримують пластинку із спермою над поверхнею рідкого азоту 1,5-2 хв після чого занурюють їх на 1-2 хв у рідкий азот, знову підіймають, нахиляють убік і згортають гранули охолодженою в рідкому азоті лопаткою з органічного скла в кювету чи в кружку з рідким азотом. Потім пересипають гранули охолоджені до температури рідкого азоту чашечку чи марлеві мішечки прикріплюють до них бирки з кличкою бугая і датою заморожування сперми опускають у посудину Дьюара з рідким азотом, яку нещільно закривають кришкою.

Заморожування сперми бугая в облицьованих гранулах (за Ф. І. Осташком). З'єднавши спермоприймач із свіжовзятою спермою із стерильною поліетиленовою місткістю (об'ємом 200-400 мл) спеціального обладнання для розріджування сперми, заповненого середовищем № 1, розріджують сперму у співвідношенні 1:1. Витримують розріджену сперму при кімнатній температурі 5-10 хв, після чого розріджують її так само середовищем № 2 до концентрації 15 млн сперміїв у дозі.

Під’єднують до місткості поліетиленову трубку діаметром 3,8-4 мм товщиною стінки 120 мкм і витісняють у неї розріджену сперму за допомогою апарата ПРЖ. Розділяють заповнену спермою трубку на частини по 0,25-0,33 мл і герметизують термічним способом. Зсипають облицьовані гранули в алюмінієві туби, закривають їх поролоновими корками й закріплюють у спеціальному пристрої для еквілібрації та заморожування сперми.

Заповнений гранулами пристрій вміщують у холодильник з температурою 2-5°С на 4-6 год, потім занурюють обойму апарата з тубами на 8-10 хв у посудину з рідким азотом, після чого опускають повністю у посудину Дьюара.

Перевірка рухливості сперміїв у розмороженій спермі. У чистий стерильний флакон з-під пеніциліну вносять 1 мл 2,9 %-го розчину цитрату натрію, закривають корком і ставлять на водяну баню з температурою 40°С. Підтягують за бирку чашечку з гранулами до горловини посудини Дьюара і анатомічним стерильним пінцетом з гладенькими обточеними краями, попередньо охолодженим до температури мінус 196°С, беруть з неї одну малу гранулу сперми й швидко опускають у флакон з підігрітим розчином цитрату натрію.

Струшують флакон для прискорення розморожування гранули. Відразу після розморожування гранули флакон виймають з теплої води, стерильною скляною паличкою беруть краплю сперми і наносять на чисте сухе предметне скло. Додають краплю теплого розчину цитрату натрію, накладають накривне скельце і оцінюють рухливість сперміїв під мікроскопом при температурі 38-40°С.

Для розморожування великих гранул (0,5-1 мл) у сухий стерильний флакон вносять 1-2 гранули і занурюють флакон у воду з температурою 38-40°С, витримують його до повного розморожування.

Облицьовані гранули та пайєти виймають з рідкого азоту широким пінцетом, вміщують у водяну баню, підігріту до температури 38-40°С, розморожують протягом 8-10 с до появи тонкого стержня льоду. Гранулу що відтанула або пайєту висушують, після чого її розкривають, наносять краплю сперми на предметне скло, додають краплю теплого цитрату натрію, накривають накривним скельцем і оцінюють активність сперміїв.

Техніка безпеки під час роботи з рідким азотом.

Під час роботи з рідким азотом необхідно дотримувати техніки безпеки:

- одягати захисні окуляри та шкіряні рукавиці; одяг техніка повинен повністю закривати оголені ділянки тіла;

- при потраплянні рідкого азоту на оголену ділянку тіла його необхідно відразу змити водою, щоб запобігти обмороженню;

- посуд з рідким азотом повинен стояти в добре вентильованому приміщенні поблизу вікна, щоб через кватирку в нижній частині вікна за допомогою гнучкого шланга можна було доливати рідкий азот. Наконечник шланга при цьому опускають на дно посудини і надійно прикріплюють до її горловини;

- під час заливання азоту не можна заглядати в горловину посуду; перед роботою треба добре провітрити приміщення; у разі запаморочення слід негайно вийти на свіже повітря;

- через кожних 15-20 заправок рідкий азот зливають з посудини Дьюара (щоб уникнути нагромадження вибухонебезпечного рідкого кисню) і заправляють посуд свіжим рідким азотом;

- не можна закривати посудину Дьюара саморобними щільними корками; не дозволяється використовувати посудину Дьюара, верхня частина якої і горловина вкриті льодом.

Зберігання сперми сільськогосподарської птиці. Зберігати сперму в стані кислотного анабіозу чи при температурі 2-5°С можна протягом декількох днів. Заморожену сперму при температурі -79 чи -196°С можна зберігати необмежено довго - роками. Досить висока запліднююча здатність сперміїв, яка зберігається роками в замороженому стані забезпечує цілий ряд зоотехнічних і економічних переваг в умовах виробництва. Розбавлену сперму розливають в ампули чи гіеніцилінові флакони, після чого ампули запаюють, а флакони закривають гумовими пробками.

Транспортувати сперму, при короткочасному зберіганні її, можна в побутових 2-3-літрових термосах Для цього в термос спочатку кладуть лід, на нього ставлять хімічну склянку, на дні якої має бути вата шаром 0,5-1 см. Ампули і флакони ставлять у склянку на вату і прикривають теж шаром вати. За таких умов сперма зберігається при температурі 2°С.

Після доставки сперми до місця призначення це їх перебуванням у стані анабіозу. У цьому можна легко переконатись, нанести на предметне скельце, підігріте до 40°С, краплю сперми і поруч з нею дві краплі цитрату натрію. Накривши ці краплі накривним скельцем визначають активність сперміїв.

Контрольні питання:

1. Як зберігають сперму бугая, барана, жеребця при t = 2-4°С?

2. Технологія охолодження сперми до t = 2-4°С.

3. Як проводять заморожування сперми бугая у вигляді гранул у скрапленому азоті на фторопластовій пластинці та у облицьованих гранул?

4. Технологія заморожування сперми плідників у пайєтах та соломинках.

5. Як перевіряють рухливість сперміїв у розмороженій спермі? Техніка безпеки при роботі з рідким азотом.

6. Зберігання та транспортуваня сперми сільськогосподарської птиці.

ТЕМА 2