Місце проведення заняття: лабораторія технології відтворення сільськогосподарських тварин.
Оснащення робочого місця: спермоприймачі зі спермою бугая, барана, кнура, жеребця, рушник, щіточка для миття рук, вата, тепла вода, термостат, скляні лійки, мірні циліндри, градуйовані мензурки з профільтрованою спермою кнура та жеребця, піпетки на 1.5, 10 мл., градуйовані мензурки та циліндри, мікроскопи, предметні та накривні скельця, столики Морозова або електрообігрівальні, піпетки, скляні палички, термостат, марлеві серветки, розчин фурациліну.
Визначення концентрації сперміїв. Оснащення заняття: нерозріджена сперма, змішувачі еритроцитарні та лейкоцитарні, лічильні камери, фотоелектроколориметр, мікроскопи, 70 %- та 96 %-й спирт, 0,5, 0,9 та 3 %-ні водні розчини натрію хлориду, гумова груша чи кулі Річардсона, стандарти для визначення концентрації сперміїв у спермі жеребця, стерильні марлеві серветки, фільтрувальний папір,
Короткі методичні вказівки. Якість сперми не є постійною, а значно змінюється залежно від умов годівлі та утримання плідників, догляду за ними, режиму їх статевого використання, стану здоров'я плідника і навіть сезону року, тому вивченню її надають важливого значення. Окомірна мікроскопічна оцінка сперми дає лише приблизне уявлення про кількість сперміїв в 1 мл сперми. Проте для встановлення раціонального ступеня розрідження та оптимальної дози сперми при осіменінні самок необхідно точно знати концентрацію у ній сперміїв.
Визначення концентрації сперміїв у спермі за допомогою лічильної камери Горяєва. Лічильна камера Горяева має вигляд товстого, відшліфованого предметного скла, у середній частині якого розміщено три поперечні пластинки. На середній пластинці, опущеній на 0,1 мм нижче бічних (опірних) пластинок, вигравійовано дві квадратні сітки, розділені на 225 великих квадратів, з яких 25, у свою чергу, розділені на 16 малих - всього 400 малих квадратів площею 1/400 мм кожний. Після притирання до опірних пластинок шліфованого накривного скельця над сіткою утворюється камера. Для зручності підрахунку сперму слід розрідити і позбавити спермії рухливості. Сперму змішують у змішувачі (меланжері) з 3 %-м розчином натрію хлориду. Сперму бугая та барана змішують у еритроцитарному змішувачі (з червоною крупинкою в кулястому розширенні та поділками на піпетці 0,5; 1 і 101), сперму жеребця і кнура – у лейкоцитарному (з білою крупинкою та поділками на піпетці 0,5; 1 та 11).
На опірні пластинки чистої лічильної камери кладуть накривне скельце і, притискаючи його великими пальцями по краях, притирають його до пластинок до появи райдужних кілець. У чистий сухий знежирений еритроцитарний змішувач (для сперми жеребця та кнура лейкоцитарний змішувач) набирають сперму бугая до мітки 1,0 або сперму барана, кнура чи жеребця до мітки 0,5, швидко витирають кінець піпетки ватою і набирають 3 %-й розчин натрію хлориду до верхньої позначки (101 чи 11). В результаті сперма барана буде розріджена у 200 разів, бугая - в 100, кнура та жеребця - у 20 разів, а спермії загинуть під дією гіпертонічного розчину натрію хлориду, що полегшить їх підрахунок. Кінці змішувача затискають між великим і вказівним пальцями і струшують протягом 2-3 хв. Видаляють перші чотири краплі рідини із змішувача на вату, оскільки в них немає сперміїв, а п'яту краплю наносять збоку на сітку камери під накривне скло. Крапля повинна рівномірно заповнити простір камери і не мати бульбашок повітря. Залишки сперми витирають марлевою серветкою.
Заправлену камеру кладуть на столик мікроскопа в точно горизонтальному положенні, наводять мікроскоп і підбирають оптимальне освітлення, опускаючи конденсор, змінюючи просвіт діафрагми чи повертаючи дзеркало. Спочатку знаходять сітку камери під малим збільшенням мікроскопа, а після цього переводять на збільшення у 400 разів (при цьому в полі зору поміститься один і великий квадрат сітки камери) і починають підрахунок! сперміїв. Необхідно підрахувати їх кількість у 5 великих або у 80 малих квадратах, розміщених по діагоналі. При підрахунку сперміїв беруть до уваги лише їхні голівки і в кожному малому квадраті рахують спермії, розміщені всередині квадрата, а також ті, що лежать головками на лівій і верхній лініях квадрата. Кількість підрахованих у кожному великому квадраті сперміїв записують окремо, а потім підсумовують.
Концентрацію сперміїв визначають за формулою:
С = (Н х Д х 400 х 1000): Nр, або
С = (Н х Д х 4000 х 1000): 80,
де С - концентрація сперміїв; Н - кількість сперміїв у 80 малих квадратах; Д - ступінь розрідження сперми у змішувачі (20; 100 чи 200); 400 - число для переведення у квадратні міліметри; 4000 - число для переведення в кубічні міліметри (об'єм одного малого квадрата становить 1/4000 мм3); 1000 - число для переведення в мілілітри (в 1мл міститься 1000 мм3);
N - кількість малих квадратів, у яких здійснюють підрахунок;
р - глибина камери, яка становить 0,1 мм.
Наприклад, при визначенні концентрації сперміїв у спермі бугая у 80 малих квадратах було підраховано 220 сперміїв. Сперму було розріджено в меланжері у 100 разів. Тоді С = (220 х 100 х 400 х 100): 80 х 0,1 = 1100000000 сперміїв в 1 мл.
Якщо глибина камери дорівнює 0,1 мм, то концентрацію сперміїв можна визначити за спрощеними формулами, поділивши кількість підрахованих у 80 малих квадратах сперміїв на 200 - для сперми бугая, на 100 - для сперми барана і на 1000 - для сперми кнура або жеребця.
Після виконання завдання треба ретельно помити лічильні камери й накривні скельця спочатку простою, а потім дистильованою водою і витерти насухо марлевою серветкою. Із змішувача видаляють залишки сперми, миють його послідовно дистильованою водою, потім 96 %-м спиртом і ефіром, висушують, продуваючи через них повітря із гумової груші чи кулі Річардсона.
Визначення концентрації сперміїв за допомогою фотоелектроколориметра ФЕК-М. Перш ніж приступити до роботи з приладом, старанно вивчають інструкцію, яка до нього додається. Потім з'єднують фотоелектроколориметр із стабілізатором і гальванометром і перевіряють справність усього приладу. За допомогою ФЕК-М можна легко і швидко визначити концентрацію сперміїв. Принцип його роботи полягає в тому, що при пропусканні через встановлену в прилад кювету зі спермою електричних променів частина їх поглинається сперміями, а решта проходить через кювету і потрапляє на фотоелемент, з'єднаний з гальванометром. При цьому через гальванометр проходить електричний струм, величина якого обернено пропорційна оптичній густині сперми. Чим вища каламутність сперми (тобто концентрація у ній сперміїв), тим більше ослаблюється потік світла, яке проходить крізь неї. При визначенні концентрації сперміїв за цим методом спочатку потрібно побудувати криву оптичної щільності сперми різної концентрації. Для цього вибирають найгустіший еякулят з концентрацією сперміїв понад 1 млрд. в 1 мл і, використовуючи 3,5 %-й розчин натрію цитрату, виготовляють серію послідовних розріджень у 2, 4, 6, 8, 10 разів і т. д. У кожній з цих проб двічі визначають концентрацію сперміїв у лічильній камері і встановлюють оптичну щільність на ФБК. Для цього у пронумеровані пешцилінові флакони наливають по 10 мл 3,5 %-го розчину натрію цитрату, набирають у мікро-піпетку 0,1 мл сперми певного розрідження, видувають її у відповідний флакон з розчином, промивають кілька разів розчином і ретельно змішують. Наливають рідину з флакона в кювету ФЕК з робочою довжиною 10 мм і ставлять у праве гніздо приладу на найбільшу відстань від фотоелемента. В ліве гніздо приладу на такій самій відстані і в запасне праве гніздо ставлять таку саму кювету з розчином натрію цитрату. Вмикають прилад. На шляху правого пучка світла стоїть кювета з розрідженою спермою. Вона затримує частину світла, тому на правий фотоелемент падає пучок меншої інтенсивності. Стрілка гальванометра при цьому відхиляється. Для вирівнювання світлових потоків у лівий потік вводять фотометричний клин (поки стрілка гальванометра не зупиниться на нулі). Тепер, щоб дізнатися, яку частину променів затримує сам розчин натрію цитрату (без сперміїв), його ставлять у правий потік світла. Знову порушується фотоелектрична рівновага. Обертами лівого барабана змінюють ширину діафрагми до повернення стрілки гальванометра в нульове положення. Записують показ лівого барабана кожної проби і будують калібрувальну криву.
Тепер, маючи калібрувальну криву, можна легко визначити концентрацію сперміїв у пробі сперми. Визначення концентрації сперміїв на ФЕК-М розпочинають через 15-20 хв. після ввімкнення лампи. Встановлюють червоний світлофільтр, а лівий відліковий барабан - на нульовій поділці за червоною шкалою оптичної щільності.
Беруть стільки чистих сухих флаконів з-під пеніциліну, скільки проб сперми треба дослідити, відповідно нумерують їх, наливають у кожний по 10 мл 3,5 %-го розчину натрію цитрату з температурою у межах 18-25°С і додають за допомогою мікропіпетки по 0,1 мл сперми з кожної досліджуваної проби. Тепер кожен такий флакон містить розріджену у співвідношенні 1:100 сперму бугая.
Сперму барана розріджують у співвідношенні 1:400, додаючи до 10 мл 3,5 %-го розчину натрію цитрату 0,025 мл сперми; сперму кнура - 1:ЗО, додаючи до 6 мл 3,5 %-го розчину натрію цитрату 0,2 мл сперми, профільтрованої крізь два шари капронової тканини.
Добре розмішану розріджену сперму наливають в одну з кювет фотоелектроколориметра з робочою довжиною 10 мм до позначки, а дві інші такі самі кювети наповнюють розчином натрію цитрату. Кювету з розрідженою спермою вміщують у правий кюветотримач приладу на шляху проходження світлового пучка ближче до джерела світла, а в лівий кюветотримач у таке саме положення - одну з кювет з розчином натрію цитрату. Другу кювету з розчином натрію цитрату вмішують у праве гніздо кюветотримача в запасне положення.
Закривають кришку приладу і вмикають гальванометр на малу чутливість (положення 1). Обертаючи ручку грубого настроювання фотометричних клинів, установлюють стрілку гальванометра на нуль, тоді перемикають гальванометр на високу чутливість (положення 2) і знову переводять його стрілку в нульове положення. Вимикають гальванометр. Трохи піднімають правий кюветотримач і, повернувши його навколо осі, змінюють положення кювет так, щоб на шляху проходження світлового пучка стала кювета з розчином натрію цитрату.
Закривають кришку приладу і знову вмикають гальванометр (спочатку на грубу чутливість) і, не чіпаючи ручки фотометричних клинів, а обертаючи вимірювальний барабан, повертають відхилену стрілку гальванометра в нульове положення. Потім перемикають прилад на високу чутливість і обертанням вимірювальних барабанів уточнюють нульове положення стрілки. Вимикають гальванометр і відліковують за червоною шкалою лівого барабана оптичну щільність досліджуваної проби й дивляться, якій концентрації сперміїв вона відповідає на градуйованій кривій.
При відсутності кривої можна користуватися спрощеним підрахунком: кожні 0,05 поділки шкали барабана відповідають 100 млн. сперміїв в 1 мл нерозрідженої сперми.
Визначення відсотка живих і мертвих та патологічних форм сперміїв. Оснащення заняття: знежирені предметні та шліфовані скельця, мікроскопи, скляні палички або очні піпетки, вата, 5 %-й розчин еозину, 1 %-й розчин натрію хлориду, 96 %-й спирт-ректифікат, розчин азуреозину, фуксину або 0,1 %-го метиленового синього.
Оболонка живих сперміїв непроникна для деяких мікробіологічних фарб, а оболонка мертвих та ослаблених сперміїв пропускає барвники, тому в пофарбованому мазку живі спермії виглядають блідими, незабарвленими, а мертві, навпаки, набувають кольору фарби. Для диференційованого фарбування сперміїв запропоновано кілька рецептів фарб: 5 %-й водний розчин еозину за В. А. Морозовим; розчин еозину на фізрозчині (водорозчинного еозину 1,7 г, натрію хлориду 1 г, води дистильованої 100 мл); еозиннігрозинова фарба за Хенкоком (еозину водорозчинного 5 г, нігрозину 30 г, дистильованої води 300 мл); еозино-нігрозинова фарба за В. А. Яблонським (еозину 5 г, нігрозину 3 г, дистильованої води 100 мл); нігрозин-еозинова фарба (еозину 0,5 г, нігрозину 10 г, дистильованої води 100 мл); нігрозин-еозинова фарба відповідно до припису Глуда (1 частина 4 %-го еозину на 2,9 %-му розчині натрію цитрату і 3 частини 8 %-го нігрозину також на розчині натрію цитрату); 1 %-й розчин фарби конго-рот та ін.
Для оцінки сперми на чисте знежирене предметне скло, ближче до одного кінця, наносять стерильною скляною паличкою чи піпеткою невелику краплю сперми і поряд з нею краплю 5 %-го розчину еозину на 3 %-му розчині натрію цитрату. Швидко перемішують краплі краєм шліфованого скла і, трохи відступивши, притискують торцевий край скла із залишками суміші до предметного скла під кутом 40-45° і швидким плавним рухом потягують його до протилежного кінця скла. Решту суміші сперми з фарбою витирають ватним тампоном. Мазок має бути таким тонким, щоб міг швидко висохнути на повітрі.
Кладуть висушений мазок на предметний столик мікроскопа і розглядають його при збільшенні в 400-500 разів.
Спермії, які під час-фарбування були живими, мають незабарвлені головки, оболонка їх непроникна для фарби, тоді як головки мертвих сперміїв забарвлюються у рожевий колір.
Підраховують у кількох полях зору підряд 500 сперміїв, рахуючи окремо живих і мертвих, та визначають відсоток живих сперміїв (П) за формулою
де П - відсоток живих сперміїв; Ж - кількість підрахованих незабарвлених сперміїв.
Визначення кількості патологічних сперміїв. У кожному еякуляті поряд з нормальними трапляються і патологічні спермії. Вміст їх не повинен перевищувати 14 % у барана, 18 % – у бугая і 20 % – у кнура та жеребця. При виникненні хворобливих процесів у статевих залозах самців кількість патологічних форм сперміїв збільшується (тератоспермія), що різко знижує запліднювальну здатність самця. Тому у племоб'єднаннях та на племпідприємствах необхідно 3-4 рази на рік визначати кількість патологічних форм сперміїв у спермі кожного плідника.
Патологічні зміни сперміїв можуть бути первинними та 9 вторинними. Тому Блом пропонує при оцінці морфології сперміїв 1 класифікувати їх на три види: нормальні, з первинними патологічними змінами та з вторинними змінами. До первинних змін відносять зміни розміру та форми головки, тіла й хвостика та їх забарвлення. Це гігантські спермії, карликові, з круглою, грушоподібною або врізаною головкою, без головок, двоголові, безхвості тощо. Вони спостерігаються при розладах сперміогенезу в сім'яниках, запальних процесах у них, при авітамінозах, порушеннях теплорегулюючої функції мошонки.
Вторинні зміни сперміїв (спермії із закрученими та обламаними хвостиками, з відокремленими ковпачками, безхвості, з проксимальною протоплазматичною краплею) виникають при розладах процесу їх дозрівання, ураженнях придатків сім'яників та сім'явивідних шляхів, додаткових статевих залоз, при порушенні режиму використання плідників, а також способу взяття сперми й від подальшого поводження з нею. Вторинні зміни можуть виникати також у процесі виготовлення препарату внаслідок механічної дії на спермії.
Свіжовзяту сперму для зручності підрахунку сперміїв розріджують 1 %-м розчином натрію хлориду: барана у 20-30 разів, бугая в 10-15, жеребця і кнура в 2-3 рази або зовсім не розріджують. Для цього до краплі сперми очною піпеткою додають відповідну кількість 1 %-го розчину натрію хлориду і обережно перемішують.
Беруть невелику краплю відповідно розрідженої сперми, наносять її на кінець знежиреного й сухого предметного скельця і, нахиливши його, дають можливість краплі стекти або роблять з неї тоненький мазок. Висушують його на повітрі протягом 1-2 хв. і фіксують 96 %-м спиртом-ректифікатом, який наносять на 1-2 хв. Споліскують дистильованою водою і фарбують розчином азур-еозину чи метиленового синього 3-5 хв. Змивають фарбу водою, висушують мазок і розглядають його під мікроскопом при збільшенні в 600 разів. У кожному полі зору підраховують і записують кількість нормальних і патологічних сперміїв, при цьому загальна кількість тих й інших має становити не менше 500. Кількість патологічних сперміїв визначають за формулою
де П – кількість підрахованих патологічних форм сперміїв; Н – кількість нормальних сперміїв, %; С – спермії.
Контрольні питання:
1. Яку сперму вважають густою, рідкою і середньою? Як вона позначається.
2. Що таке аспермія і олігоспермія?
3. Як визначають % живих і мертвих сперміїв способом зажиттєвого фарбування?
4. Як підраховують патологічні форми сперміїв? Як називають таке явище?
5. Як визначають концентрацію сперміїв за допомогою лічільної камери Горяева?
6. Як визначають концентрацію сперми бугая за допомогою фотоелекрокалориметра.
7. Як визначають концентрацію сперміїв за допомогою стандартів каламутності?
ТЕМА 9
