Санітарна оцінка технологічних процесів у роботі

Зі спермою плідників

Місце проведення заняття: лабораторія технології відтворення сільськогосподарських тварин.

Оснащення робочого місця: сперма, змиви з препуція та інстру­ментів, середовища для розрідження сперми, живильні середовища МПА, МПБ, Кітта-Тароцці, Буліржа, Літмана, Лен НДВІ, Сабура, Чапека, МПА у бактеріологічних чаш­ках, термостат, предметні та покривні стекла, бактеріоло­гічні фарби, мікроскопи.

Візьміть змив із препуція. Зафіксуйте плідника в спеціальному станку, зробіть туалет препуція, вставте в його канал стерильну гумову трубку чи катетер і, з’єднавши її з шприцем, введіть у по­рожнину препуція 5-10 мл стерильного фізрозчину, за­тиснувши край препуція рукою, енергійно помасажуйте його. Наберіть розчин у шприц і вилийте в стерильну про­бірку.

Визначте колі-титр сперми та змиву з пре­пуція. Поставте у штатив сім стерильних пробірок, внісши у першу і мл змиву чи сперми і, додавши 1 мл стерильного фізрозчину, одержите розбавлення 1:1. Наберіть і перене­сіть з неї і мл суміші в наступну пробірку і додайте 10 мл стерильного фізрозчину. Так само перенесіть з другої про­бірки 1 мл суміші в третю й додайте 10 мл фізрозчину, з третьої у четверту і т. д. Таким чином одержите серію роз­ріджень 1:1; 1:10; 1:100; 1:1000; 1:10000; 1:100000; 1:1000000.

З кожного розрідження зробіть висів на середовище Бу­ліржа. Витримавши посіви 24 год у термостаті при температурі 37-37,6 °С, перевірте, чи не змінився колір середовища і чи не з’явився у газових трубочках газ.

Колі-титр сперми не повинен перевищувати 1:1—1:10, змиву з препуція 1:100.

Визначте мікробне та грибкове забрудиеиия сперми та препуція. Візьміть стерильну чашку та градуйовану піпетку. Наберіть у піпетку 0,1 мл сперми чи змиву і, привідкривши кришку чашки, внесіть сперму на поверхню агару. Роз­мажте його рівномірно стерильним шпателем. Поставте бактеріологічну чашку в термостат на 24 год. Після цього підрахуйте кількість колоній і визначте вид мікробів.

Дослідіть сперму та змив із препуція на на­явність синьогнійної палички. Візьміть заздалегідь приготовлені стерильні бактеріаль­ні чашки з МПБ з додаванням 1-2 % цукру і, зробивши посів сперми та змиву з препуція, поставте їх на 6-7 діб у термостат при температурі 37°С, перевіряючи посів кож­них 1-2 дні.

Про наявність синьогнійної палички судять по зелено-голубому забарвленню середовища під впливом виділюва­ного нею піоціаніну.

Дослідіть сперму на наявність анаеробних мікробів. Візьміть дві пробірки із середовищем Кітта-Тароцці і внесіть у них по 0,1 мл досліджуваної сперми. Прогрійте одну з пробірок на водяній бані при 80°С протягом 20 хв для знищення супутної вегетативної мікрофлори і поставте обидві пробірки в термостат на 10 діб при 37°С. Після цього через 3-4 дні необхідно оцінити інтенсивність росту мікробів, характер осаду, наявність та ступінь газоутво­рення, зробити з них мазки, зафарбувати за Грамом і про­цвести мікроскопію.

Дослідіть сперму та змив із препуція на вміст грибів. Зробіть посів сперми та змиву з препуція на одне з спе­ціальних середовищ — Літмана, Лен НДВІ, Сабура чи Ча­пека; прокультивуйте їх в термостаті 10-45 днів при тем­пературі 22-37°С. Перевірте виділені гриби на патоген­ність.

Перевірте стерильність синтетичних середо­вищ для розрідження сперми, користуючись методикою, викладеною в завданні 3.

Проведіть бактеріологічний контроль при­ладів та інструментів, які використовують для одержання та введення сперми. Взявши 5-10 мл стерильного фізрозчину, зробіть зми­ви з підготовленої штучної вапни, шприца-катетера, піхво­вого дзеркала. Внесіть по 0,1 мл змиву в МПБ та середови­ще Кітта-Тароцці.

Дальше дослідження робіть як при визначенні мікроб­ного забруднення сперми.

Визначте мікробне та грибкове забруднення повітря лабораторії, манежу та приміщення для плідників. Поставте на 5 хв у різних ділянках приміщення на відстані 1,5 м від підлоги відкриті бактеріологічні чашки з МПА. Після цього перенесіть їх у термостат і щоденно під­раховуйте кількість колоній та визначте видовий склад мікробів. При виявленні грибів зробіть з них посіви на спе­ціальні середовища для визначення їх видового складу.

 

Контрольні питання:

1. Як взяти змив із препуція?

2. Як визначаеться колі-титр сперми та змив з пре­пуція?

3. Як визначаеться мікробне та грибкове забруднення сперми та препуція?

4. Дослідження сперми та змиву із препуція на наявність синьогнійної палички та вміст грибів

5. Дослідження сперми на наявність анаеробних мікробів.

6. Як провести бактеріологічний контроль приладів та інструментів, які використовують для одержання та введення сперми.

ТЕМА 10

Розрідження сперми

Місце проведення заняття: лабораторія технології відтворення сільськогосподарських тварин.

Оснащення робочого місця: Свіжоодержана сперма бугая і кнура, розріджена сперма бугая, барана, жеребця, дистильована вода, аптечні терези з наважками, необхідні реактиви: натрію цитрат, глюкоза, лактоза, глікол, калію-фосфат, хелатон, двовуглекислий натрій, магнію-сульфат, цитратна кислота, калію хлорид, спермосан, свіжі курячі яйця, мензурки, змішувачі, бактеріологічні чашки, шприци, пеніцилінові флакони, гумові корки для них, марлеві серветки, спиртові тампони, паперові фільтри; пінцети, термометри, мікроскопи, обігрівальні столики, предметні та накривні скельця, термоси, водяна баня, електроплитка, таз з теплою водою, градуйовані піпетки, термоси різних конструкцій, пластмасові круглі коробки для складання ампул, вата сіра, лід, посудини Дьюара, гумові рукавиці, спеціальні обладнання для розрідження сперми.

Попередні зауваження. При розробці технології штучного осіменіння для кожного виду сільськогосподарських тварин були запропоновані середовища для розрідження сперми (глюкозо-фосфатне, жовтково-фосфатне, жовтково-цитратне, глікокол-жовтково-цитратне, молочне та ін.). Найпоширенішими для короткочасного зберігання є глюкозо-жовтково-цитратні середовища для сперми більшості видів сільськогосподарських тварин. Перехід на використання замороженої сперми для осіменіння корів і телиць їх дещо відтіснив, проте на практиці і в наукових дослідженнях іноді вдаються до короткочасного зберігання сперми, тому цей метод потрібно знати.

Слід дотримуватися таких вимог щодо розрідження сперми:

- розріджувачі мають бути ізотонічними зі спермою, тобто осмотичний тиск у них має дорівнювати тиску всередині спермія;

- розріджувачі готують лише у скляному посуді, заздалегідь вимитому, простерилізованому і висушеному;

- розріджувач готують безпосередньо перед отриманням сперми від плідника. Час від моменту приготування і до використання розріджувача має становити не більше 1-2 год;

- температура розріджувача в момент розрідження повинна бути 30-35°С для сперми бугая, кнура і жеребця і 25-30°С - для сперми барана;

- для пригнічення мікрофлори до складу розріджувачів додають сануючі речовини в таких кількостях (з розрахунку на 100 мл): стрептоцид - 120 мг, пеніцилін кристалічний (натрієва або калієва сіль) - 25-50 тис. МО, стрептоміцин сірчано- або солянокислий 25-50 тис. МО. У середовища для кімнатних температур їх вводять у подвійній кількості;

- при розрідженні сперми розріджувач приливають до сперми, а не навпаки;

- перед розрідженням і після нього визначають рухливість сперміїв.

Виготовлення розріджувачів. Глюкозо-жовтково-цитратний розріджувач сперми бугая. Підвішують аптечні терези на штативі та зрівноважують їх, кладуть на обидві шальки терезів паперові фільтри однакових розмірів і ще раз зрівноважують терези.

У велику чисту хімічну колбу на 3 л наливають бідистильованої води (для усієї групи), накривають її паперовим чи поліетиленовим ковпаком, ставлять на електроплитку, доводять до кипіння й охолоджують до температури 35°С.

На ліву шальку терезів пінцетом, що є в коробці з наважками, кладуть трьохграмовий тягарець, відкривають банку з глюкозою, набирають її чистою роговою ложечкою і всипають необхідну кількість на паперовий фільтр, що лежить на правій шальці терезів. Насипають відважену кількість глюкози в чисту суху колбу на 100 мл і роблять про це відмітку на колбі або кладуть біля неї аркуш паперу з рецептом розріджувача та роблять у ньому відповідні позначки. Знову кладуть папірець на терези, старанно витирають рогову ложечку ваткою від решток глюкози, відважують так само 1,4 г натрію цитрату і 120 мг стрептоциду та всипають їх у ту саму колбу. Відмірюють 100 мл перевареної і охолодженої до 35°С дистильованої води, вливають її у колбу з відваженими реактивами, розмішують скляною паличкою до повного їх розчинення і фільтрують крізь стерильний паперовий фільтр. Після цього куряче яйце миють щіткою, витирають насухо марлевою серветкою і протирають шкаралупу тампоном, просоченим 70 %-м спиртом або витримують його 10-15 хв. у настільній бактерицидній камері під ультрафіолетовими променями. За допомогою стерильного скальпеля чи пінцета розколюють шкаралупу яйця на дві половини і, перекладаючи жовток з однієї половини на другу над чашкою, відокремлюють його від білка.

Перекладають жовток на стерильний аркуш фільтрувального паперу і, перекочуючи його по паперу, обсушують від решток білка. Складають краї паперу вдвоє, трохи стиснувши жовток, проколюють стерильним скальпелем його оболонку і зливають у стерильну мензурку, витісняють рештки жовтка, легко здавлюючи фільтр із зовні.

Відмірюють 12 мл жовтка і вносять у колбу з розчиненими у ній компонентами. Старанно розмішують, накривають стерильною серветкою і ставлять в термостат чи каструлю з теплою водою (25-35°С).

Беруть флакон пеніциліну, дивляться, скільки в ньому одиниць дії, відкривають його, зважують на аптечних терезах масу препарату, що містить 75-100 тис. ОД, і вносять її у колбу. Так само вносять у колбу, в якій готують розріджувач, 75-100 тис. ОД стрептоміцину.

Якщо неможливо відважити необхідну кількість антибіотиків, то вливають у флакон з антибіотиком 4 мл перевареної і охолодженої до 20°С дистильованої води, після повного розчинення препарату набирають необхідну його кількість і вносять у колбу, де готують розріджувач.

При приготуванні великої кількості розріджувача підбирають флакони з необхідною кількістю антибіотиків.

Глюкозо-фосфатне-жовткове середовище для сперми барана. Відважують послідовно 3,2 г глюкози медичної безводної, 2,08 г двозаміщеного 12-водного натрію фосфату, 0,08 г однозаміщеного калію фосфату, 0,1-0,2 г розчинного стрептоциду, по 50-75 тис, ОД пеніциліну та стрептоміцину. Відмірюють 100 мл кип'яченої і охолодженої до 36°С дистильованої води, вливають її у колбу з відваженими реактивами, розмішують скляною паличкою до повного розчинення складників і фільтрують.

Додають 20 мл жовтка курячого яйця (як описано вище). Накривають колбу з розріджувачем стерильною серветкою і ставлять у каструлю з теплою водою.

Глюкозо-хелатоцитратно-сульфатне середовище (ГХЦС) для розрідження сперми кнура. Наливають у чисту хімічну колбу 100 мл дистильованої води, додають 4 г глюкози, накривають паперовим ковпаком ставлять на електроплитку і кип'ятять 1-2 хв. Знімають колбу з вогню, охолоджують її вміст до 80°С, додають 3,8 г натрію цитрату, 0,5 г двовуглекислої соди, а потім при температурі 55-58°С додають 2,6 г хелатону. Коли середовище охолоне до 40-45°С, додають 25-30 тис. ОД спермосану.

Перевірка якості виготовлених розріджувачів. Чистою стерильною скляною паличкою наносять на предметне скло краплю нерозрідженої сперми з відомою рухливістю сперміїв. Поряд з нею наносять краплю перевірюваного розріджувача, накривають покривним скельцем і оцінюють під мікроскопом при температурі 38-40°С рухливість сперміїв на межі злиття обох крапель. Якщо вона не знизилася, то розріджувач можна використовувати.

Розрідження сперми. Виготовивши розріджувач, кожна підгрупа студентів розріджує сперму відповідно до отриманого завдання з таким розрахунком, щоб уся група виготовила серію розріджень, починаючи від 1:1 до 1:100.

Посуд для розріджування сперми нагрівають у термостаті чи на водяній бані до температури 30-35°С. Спочатку розріджують сперму у термоприймачі у співвідношенні 1:1, обережно додавши до неї (по стінці) однакову кількість розріджувача. Потім переносять у підігрітий до 30-35°С градуйований змішувач 1 мл цієї сперми і доливають до неї поступово по стінці таку кількість розріджувача, щоб досягти необхідного ступеня розрідження. Після доливання кожної порції розріджувача старанно змішують його зі спермою.

Після розрідження сперми перевіряють її на рухливість сперміїв. Щоб порівняти вплив різного ступеня розрідження сперми на рухливість сперміїв, на чисте предметне скло наносять поступово краплі сперми різного ступеня розрідження (використовуючи також сперму, розріджену іншими студентами), уважно розглядають їх і оцінюють активність сперміїв. Дані про оцінку записують у вигляді таблиці.

Розрідження сперми самців сільськогосподарських птахів. Синтетичні розріджувачі сперми мають сприяти тривалому зберіганню запліднюючої здатності сперміїв. Це можливо лише при використанні відповідних речовин для приготування розріджувачів.

Для приготування розріджувачів необхідно, згідно рецепту, вагову дозу компонентів всипати в стерильну колбу і її легенько струшувати. Потім у цю колбу доливають потрібну кількість дистильованої води, в якій, легко помішуючи, розчиняють компоненти розріджувача.

Готують рідкий розріджувач у день його використання, оскільки тривале зберігання призводить до погіршення його якості. Тільки в замороженому стані розріджувачі можна зберігати тривалий час.

Розбавляти сперму птахів слід зразу після її одержання. Для цього перед одержанням сперми в градуйований спермоприймач наливають потрібну кількість розріджувача, підігрівають до 35-37°С. Після закінчення одержання сперми в спермоприймач добавляють розріджувач, щоб забезпечити потрібну концентрацію сперміїв у дозі осіменіння.

Для санації сперми птахів було запропоновано декілька антибіотиків. Так, антибіотик олеморфоциклін у концентрації 25-50 ОД/мл здійснює задовільну бактерицидну дію на мікрофлору сперми півня, індика і нетоксичний для сперміїв.

Для санації сперми гусаків використовують спермосан-3 при концентрації 50000 ОД на 100 мл розріджувача.

Розбавлену сперму можна використовувати тільки за умови високої рухливості сперміїв (7-10 балів).

Однією з суттєвих особливостей сперміїв є значна перевага у них процесів дисиміляції над створенням кислотного анабіозу сперміїв (часто використовують перший і другий фактори одночасно).

 

Контрольні питання:

1. Яких вимог треба дотримуватися при виготовленні розріджувачів?

2. Як готують ГЖЦ розріджувач для сперми бугая?

3. Як готують ГФЖ розріджувач для сперми барана?

4. Як готують ГХЦС розріджувач для сперми кнура?

5. Як перевіряють якість розріджувачів?

6. Значення основних компонентів розріджувачів для життєдіяльності сперміїв.

7. Яке значення мають антибіотики при введенні їх в склад розріджувачів?

8. Розрідження сперми самців сільськогосподарських птахів.

 

 

ТЕМА 11