Концевая дезоксинуклеотидилтрансфераза

Рестриктазы

Рестриктазы, эндодезоксирибонуклеазы – ферменты, которые узнают в ДНК определённые специфические для каждого фермента последовательности нуклеотидов и расщепляет их, если она не модифицирована в этих же участках сайт-специфическими метилазами. Уже описано около 2500 рестриктаз, выделенных из разных микроорганизмов. Модификация заключается в метилировании ферментом ДНК-метилазой определённых оснований в последовательности, узнаваемой сопряжённой рестриктазой; тем самым обеспечивается защита данного участка ДНК от воздействия рестриктазы. Одновременное наличие в клетке этих двух ферментативных активностей (так называемая R-M система) препятствует гидролизу собственной нуклеиновой кислоты. Но при проникновении в бактериальную клетку чужеродной ДНК, например бактериофага, эта ДНК служит субстратом для обоих ферментов. Следовательно, часть вирусной ДНК разрушается, а часть метилируется, тем самым становясь «непреступной» для рестриктаз. Первоначально считали, что функцией R-M систем является защита клеток от инфицирования фагами. Но позже сделали предположение о том, что R-M система осуществляет функцию ограничения скрещивания между различными бактериальными видами и штаммами, которая, однако, не абсолютна и позволяет части чужеродной ДНК поступать в клетку и встраиваться в ДНК бактерии. Открытие большого числа рестриктаз и изучение их свойств позволило выявить некоторые закономерности функционирования ферментов и разделить их на три класса. Основой классификации служат в первую очередь потребность фермента в кофакторах и характер расщепления ДНК.

Рестриктазы класса I. Они обладают следующими свойствами: требуют в качестве кофакторов аденозинтрифосфат (АТФ), S-аденозинмонофосфат (SAM), ионы Mg²⁺. В едином субъединичном мешке имеются такие ферментативные активности, как расщепление ДНК, его метилирование и узнавание специфической последовательности ДНК. Они узнают строго специфичные участки ДНК, но разрыв цепи происходит случайным образом на расстоянии 400-7000 пн (пар нуклеотидов), а продукты расщепления ДНК гетерогенны.

Рестриктазы класса II. Системы R-M класса II состоят из отдельных белков, что упрощает их изучение и использование для расщепления молекул ДНК. Рестриктазы этого класса – относительно просто организованные белки. Их отличительной чертой является то, что они узнают и разрезают ДНК по специфичным нуклеотидным последовательностям длинной от 4 до 8 пн, и в результате образуется дискретный набор фрагментов ДНК. В качестве кофакторов рестриктазам класса II необходимы только ионы Mg²⁺. В результате расщепления ДНК (рис.2), ряд ферментов образуют фрагменты с тупыми концами, не имеющие выступающих одноцепочечных участков, а другие расщепляют с образованием высококомплементарных одноцепочечных липких концов (как 5’-концов, так и 3’-концов). Важно, что при смешивании фрагментов с комплементарными липкими концами в определённых условиях они могут реассоциировать (слипаться). Все эти свойства сделали рестриктазы класса II наиболее часто используемыми при конструировании гибридных молекул ДНК.

Рестриктазы класса III имеют некоторые сходства в строении с рестриктазами класса II. Они узнают несимметричные последовательности длиной 5-6 пн и расщепляют ДНК в стороне от участков узнавания на расстоянии 24-27 пн, образуя одноцепочечные 5’-концы длиной 2-3 нуклеотида. Для проявления активности им требуются АТФ, SAM, ионы Mg²⁺. При действии ферментов данного класса in vitro не удаётся исчерпывающе гидролизовать ДНК, что является их отличительной особенностью.

Рестриктазы широко распространены в царстве прокариот, как в аэробах, так и в анаэробов. Но есть штаммы, которые не содержат R-M систем, иногда их называют «нулевыми». Рестриктазы были найдены и в зиготах хлореллоподобной водоросли, которые осуществляли гидролиз хлоропластной ДНК, исходя из этого можно предположить, что хлоропласты произошли из цианобактерий.

4) Рассмотрим основные свойства ферментов, наиболее часто используемых в генно-инженерных работа

Рестриктазы

ДНК-лигаза

Рестриктазы осуществляют расщепление ДНК, значит, существует фермент, воссоединяющий фрагменты молекулы ДНК. В 1967 г. независимо в нескольких лабораториях был открыт фермент, названный ДНК-лигазой, который катализирует синтез фосфодиэфирной связи между 5’-фосфатным (5’-р) и 3’-гидроксильным (3’-ОН) концами в двуцепочечной ДНК. Были обнаружены два типа ДНК-лигаз: один фермент синтезируется в клетках E.coli, другой же фермент, появляется в клетках E.coli при их инфицировании фагом Т4. Данные ферменты различаются по потребности в кофакторах. ДНК-лигаза E.coli в качестве кофактора требует дифосфопиридиннуклеотид, в то время как лигаза фага Т4 – АТФ, а также она способна катализировать реакцию воссоединения двухцепочечных фрагментов ДНК с тупыми концами. Поэтому в генно-инженерных экспериментах предпочитают использовать ДНК-лигазу фага Т4, как более универсальный фермент.

Возможны два типа реакций синтеза фосфодиэфирной связи:

1. Лигирование липких концов. Соединение фрагментов ДНК с полностью комплементарными липкими концами. Частным случаем такой реакции является лигирование ника (nick) – разрыва в одной из нитей двухцепочечной ДНК.

2. Лигирование тупых концов. Таким образом, ДНК-лигаза фага Т4 обеспечивает ковалентное соединение любых двухцепочечных фрагментов ДНК, для которых имеется возможность состыковать 5’-р и З’-ОН концы. Поэтому она является одним из важнейших ферментов, на использовании которых основаны современные методы рекомбинации молекул ДНК in vitro.

ДНК-полимераза I E. сoli

ДНК-полимераза I Е. coli (PolI) была обнаружена А.Корнбергом с сотрудниками в 1958 г. Этот фермент явился первой найденной полимеразой. Он представляет собой мономерную полипептидную цепь и имеет трёхдоменную структуру. Каждый домен белка обладает отдельной ферментативной активностью: N-концевой домен – 5’-З’-экзонуклеазной; С-концевой – 5’-3’-полимеразной; средний домен – 3’-5’-экзонуклеазной. Она способна связываться с одноцепочечными участками ДНК в количестве примерно одна молекула на 300 нуклеотидных остатков. Рассмотрим ферментативные активности ДНК-полимеразы I Е. coli.

5’-3’-полимеразная активность. Для реакции необходимо наличие одноцепочечной ДНК-матрицы и комплементарного участку этой цепи фрагмента – праймера (затравки) с З’-ОН концом.

3’-5’-экзонуклеазная активность. Одноцепочечная или двухцепочечная ДНК гидролизуется с З’-ОН конца. Необходимо подчеркнуть, что 3’-5’-нуклеаза расщепляет диэфирную связь только в неспаренных участках ДНК.

Две эти активности дополняют друг друга во время полимеразной реакции, поскольку в растущую цепь может включиться некомплементарный нуклеотид. Однако полимераза не может присоединять нуклеотид к неправильно спаренному концу, образовавшемуся при её участии. На помощь приходит 3’-5’-экзонуклеаза, убирающая ошибочный нуклеотид, на место которого затем присоединяется правильный. 3’-5’-экзонуклеолитическая активность проявляется в направлении, обратном синтезу ДНК. Следовательно, важную роль играет 3’-5’-экзонуклеолитическая активность в обеспечении точности полимеризации.

5’-3’-экзонуклеолитическая активность деградирует одну цепь двухцепочечной ДНК, начиная со свободного 5’-конца. В отличие от 3’-5’-экзонуклеазы 5’-3’-экзонуклеаза расщепляет диэфирную связь только в спаренных участках двухцепочечной молекулы ДНК, более того она способна отщеплять с 5’-конца олигонуклеотиды длиной до десяти остатков. Скорость нуклеазного отщепления увеличивается на порядок при одновременно протекающей реакции полимеризации. При этом возрастает относительное количество олигонуклеотидов в продуктах гидролиза ДНК. Благодаря такому сочетанию ферментативных активностей ДНК-полимераза I Е. coli играет важную роль в репарации повреждений ДНК in vivo.

Обратная транскриптаза

При изучении ретровирусов, геном которых представлен молекулами РНК, было обнаружено, что в процессе внутриклеточного развития они проходят стадию интеграции своего генома в виде ДНК в хромосому клетки-хозяина. Х.Темин выдвинул гипотезу о существовании фермента, способного синтезировать на РНК-матрице комплементарную ДНК. А в 1970 г. Х.Темин и С.Мизутани и независимо от них Д.Балтимор открыли такой фермент в препарате внеклеточных вирионов вируса саркомы Рауса. Данная РНК-зависимая ДНК-полимераза получила название ревертаза (обратная транскриптаза). Ревертаза обладает тремя ферментативными активностями:

1. ДНК-полимеразной, использующей в качестве матрицы как РНК, так и ДНК. Для начала синтеза необходим короткий двухцепочечный участок – праймер. Им может быть одноцепочечный сегмент как РНК, так и ДНК, которые в процессе реакции оказываются ковалентно связанными с новосинтезированной цепью ДНК.

2. активностью рибонуклеазы Н, гидролизующей РНК в составе гибрида РНК-ДНК, но не одно- или двухцепочечную РНК.

3. ДНК-эндонуклеазы.

Первые две активности необходимы для синтеза вирусной ДНК, а эндонуклеаза, по-видимому, важна для интеграции вирусной ДНК в геном клетки-хозяина. Обратную транскриптазу используют преимущественно для транскрипции матричной РНК в комплементарную ДНК.

Нуклеаза Bal31

В 1975 г. X.Грэй с соавторами, изучая внеклеточные нуклеазыAlteromonas espejiana Ваl31, обнаружили фермент, который функционирует: 1) как экзонуклеаза, катализирующая удаление малых олигонуклеотидов или мононуклеотидов одновременно с 5’- и 3’-концов двухцепочечной ДНК, причем обе цепи ДНК деградируют примерно с одинаковой скоростью; 2) как эндонуклеаза, специфичная к одноцепочечной ДНК. Данный фермент получил название нуклеаза Ваl31.

Способность нуклеазы Ваl31 вызывать деградацию с концов одновременно обеих цепей молекулы ДНК привлекла к этому ферменту внимание исследователей. Оказалось, что образовавшиеся после обработки Ваl31 фрагменты ДНК можно сшить с помощью ДНК-лигазы фага Т4 с другими молекулами ДНК, имеющими тупые концы. Этот фермент используется при конструировании гибридных молекул ДНК, когда необходимо в их составе сблизить какие-либо функционально значимые генетические элементы.

Концевая дезоксинуклеотидилтрансфераза

В 1962 г. Ф.Боллум обнаружил в тимусе телёнка необычный фермент, названный концевой дезоксинуклеотидилтрансферазой, или терминальной трансфераюй. Данный фермент катализирует последовательное присоединение дезоксинуклеотидов к 3’-ОН-концу молекулы ДНК. Субстратом терминальной трансферазы при использовании в качестве кофактора ионов Mg²⁺ является одноцепочечная ДНК с З’-ОН- концом или двухцепочечная ДНК с выступающим одноцепочечным З’-ОН-концом. При использовании в качестве кофактора ионов Со²⁺этот фермент может катализировать присоединение дезоксинуклеотидов к З’-ОН концу двухцепочечной ДНК с тупыми концами или даже к З’-ОН-концу двухцепочечной ДНК с выступающим одноцепочечным 5’-p-концом. При введении в реакцию, направляемую терминальной трансферазой, лишь одного типа дезоксинуклеотидов образуются молекулы ДНК, имеющие гомополимерные одноцепочечные 3’-концы.