Существует ряд методов получения чистых культур микроорганизмов. Наиболее распространенными способами получения чистых культур в производственных условиях являются методы истощающего посева, основанные на механическом разделении клеток и выращивании их потомства в виде изолированных колоний:
5.2.1 истощающий посев газоном;
5.2.2 истощающий посев штрихом по секторам;
5.2.3 истощающий посев розливкой.
5.2.1 Истощающий посев газоном
Посев производится на трех пронумерованных чашках Петри (1,2,3) с питательной средой. Посев производится простерилизованным в пламени спиртовки и охлажденным стеклянным шпателем Дригальского.
На поверхность питательной среды в чашке 1 наносят петлей или стерильной пастеровской пипеткой каплю исследуемого материала и растирают ее стерильным шпателем, двигая его сначала взад и вперед на небольшом участке, а затем круговыми движениями по всей питательной среде. При этом чашку приоткрывают левой рукой настолько, чтобы в щель мог пройти только лишь шпатель.
Вынимают шпатель из чашки 1, закрывают ее и быстро переносят шпатель в чашку 2, не прожигая его. Растирают материал по всей поверхности среды, прикасаясь к ней той же стороной шпателя, которой растирался материал в чашке 1. Чашку 2 закрывают.
Затем переносят шпатель в чашку 3 и растирают материал по поверхности среды. Закрывают чашку, шпатель прожигают или опускают в дезинфицирующий раствор. Чашки подписывают и ставят в термостат вверх дном. Через сутки на чашке 1, где было много материала, получается сплошной рост бактерий, и отдельных колоний нет. На чашке 2 и, в особенности на чашке 3, колонии распределились изолированно. Поэтому они легко доступны исследователю.
5.2.2 Истощающий посев штрихом по секторам
Соблюдая правила стерильности, разливают питательную среду в чашки Петри. Затем дают среде остыть, слегка подсушивают ее в термостате. Затем чашку переворачивают вверх дном и расчерчивают карандашом по стеклу на четыре сектора. Чашку переворачивают крышкой вверх.
Приоткрыв чашку Петри, на один из секторов наносят каплю микробной взвеси, распределяют петлей на небольшой площадке, затем делают посев штрихом поочередно в каждом секторе. Сеять нужно осторожно, слегка прикасаясь петлей, чтобы не повредить среду. Посевы подписывают и термостатируют. Через сутки в первых секторах наблюдается сплошной рост по штриху, а в последнем секторе вырастают изолированные колонии.
5.2.3 Истощающий посев розливкой
Этот метод получения чистых культур был впервые предложен Робертом Кохом и поэтому иначе называется методом пластинчатых разводок Коха или методом чашечных культур Коха.
При выделении чистой культуры бактерий методом Коха основным условием является предварительное разведение концентрации микроорганизмов в исследуемом материале с таким расчетом, чтобы при посеве его на питательной среде выросли изолированные колонии. Этот метод употребляется в тех случаях, когда нужно произвести количественное определение микроорганизмов в определенном объеме исследуемого материала (вода, молоко, пиво, зерновая болтушка и т.д.). Разведение исследуемого материала можно производить как непосредственно в питательной среде при посеве, так и в стерильной водопроводной воде перед посевом.
Рисунок 4 - Выделение чистых культур методом
пластинчатых разводок Коха
В первом случае берут несколько пробирок с 9 см3 МПА, расплавляют их в водяной бане, охлаждают до 50-55°С и помещают в стакан с водой, имеющий примерно такую же температуру. Стерильной пипеткой набирают 1см3 исследуемого материала, вносят в первую пробирку с МПА и перемешивают. Получается первое разведение – 10-1 (1:10). Второй стерильной пипеткой забирают 1см3 разведения 10-1, переносят во вторую пробирку, перемешивают, получая разведения 10-2 (1:100) и т.д. Количество пробирок, взятых для опыта, зависит от степени загрязненности исследуемого материала. Затем полученные разведения в питательной среде выливают в чашки Петри, предварительно согретые в термостате во избежание неравномерного застывания агара. Пробирки берут по порядку, обжигают край, вливают содержимое в чашку Петри, открывая их настолько, чтобы в щель вышло лишь устье пробирки.
Опорожненные пробирки опускают в дезинфицирующий раствор. Покачивая чашки, распределяют МПА равномерно по всей поверхности дна.
Во втором случае проводят аналогичное разведение исследуемого материала, но в стерильной водопроводной воде, получая разведение 10-1, 10-2, 10-3 и т.д. Затем забирают отдельными стерильными пипетками из каждой пробирки по 0,1-1 см3 соответствующего разведения, вносят в стерильные чашки Петри, осторожно приподнимая их крышки, и заливают примерно 10 см3 расплавленного, но охлажденного до 45°С МПА. Легким покачиванием чашки среду равномерно распределяют по дну и дают ей застыть. Затем чашки переворачивают вверх дном, подписывают и ставят в термостат для выращивания микроорганизмов.
