Существует два основных способа приготовления прижизненных препаратов микроорганизмов: «висячая капля» и «раздавленная капля».
2.2.1.1 Препарат «висячая капля». Небольшую каплю взвеси микробных клеток наносят на покровное стекло и осторожно накладывают на него предметное стекло так, чтобы капля свободно помещалась в центре углубления. Края луночек предварительно смазывают вазелином, препарат переворачивают и микроскопируют. Этот метод применяют, главным образом, для изучения подвижности микроорганизмов.
2.2.1.2 Препарат «раздавленная капля» неокрашенный (нативный). На предметное стекло наносят каплю жидкости (при работе с бактериями - водопроводную воду, при работе с микроскопическими грибами - смесь равных объемов этилового спирта и глицерина), вносят в нее немного исследуемых микроорганизмов, размешивают и накрывают покровным стеклом, осторожно накладывая его по ребру во избежание образования пузырьков. Излишек выступившей жидкости удаляют фильтровальной бумагой. Выращенные на плотной питательной среде бактерии переносят в каплю жидкости с помощью бактериологической иглы, а микроскопические грибы - двумя препаровальными иглами. Культура, выращенная в жидкой среде, например, дрожжи, помещается на предметное стекло стерильной пипеткой без предварительного нанесения капли жидкости. Микроскопируют препарат сухими объективами. Препарат позволяет установить форму клеток преимущественно крупных микроорганизмов, их размеры, расположение, подвижность.
2.2.1.3 Препарат «раздавленная капля» прижизненно окрашенных микроорганизмов. К капле микробной суспензии на предметном стекле добавляют каплю слабого раствора (1:1000) красителя (метиленового синего или фуксина), размешивают, затем накрывают покровным стеклом.
Подобным образом рекомендуется дифференцировать живые и мертвые клетки, например, при исследовании пекарских дрожжей. Мертвые клетки обычно прокрашиваются быстрее и ярче за счет посмертного повышения проницаемости клеточной оболочки.
Внимание! Отработанные препараты живых микроорганизмов помещают в сосуд с дезинфицирующим раствором для обезвреживания.
2.2.2 Приготовление фиксированного и окрашенного препарата
Фиксированными и окрашенными препаратами называются такие препараты, в которых микроорганизмы зафиксированы, т.е. убиты, прикреплены к стеклу, а после этого окрашены. При фиксации быстро прерываются жизненные процессы микробной клетки и сохраняется неизменной их тонкая структура. Окраска препарата осуществляется специальными красителями. Она значительно повышает контрастность препаратов и позволяет изучить не только форму бактериальной клетки, но и ее строение.
Микроскопия фиксированных и окрашенных препаратов является основным методом изучения морфологии бактерий.
В приготовлении фиксированного и окрашенного препарата различают несколько этапов:
1) Приготовление мазка. На обезжиренное чистое предметное стекло наносят каплю воды, вносят в нее небольшое количество исследуемой культуры бактерий, взятой с плотной питательной среды стерильной бактериологической петлей, растирают ее тонким слоем на поверхности с двух-, трехкопеечную монету. Мазок должен быть тонким, равномерно растертым, небольшим.
В случае роста бактерий на жидкой питательной среде на стекло наносят только каплю микробной взвеси.
2) Высушивание мазка на воздухе осуществляется при комнатной температуре и служит для удаления лишней влаги.
3) Фиксация мазка. Она направлена на уничтожение микроорганизмов и прикрепление их к стеклу. Различают термическую и химическую фиксации. При термической фиксации стекло с мазком, обращенным к верху, проводят 3-4 раза в пламени спиртовки. При химической фиксации мазок обрабатывают этиловым, метиловым спиртом, смесью спирта с эфиром, но такая фиксация более длительна.
При фиксации микробы погибают, клетки прикрепляются к стеклу, улучшается их окрашиваемость.
4) Окрашивание препарата. Предполагает обработку различными красителями для контрастирования микроорганизмов.
В лабораторной практике существуют простые и сложные способы окрашивания.
Простая окраска позволяет быстро и хорошо ознакомиться с общей морфологией микроорганизмов. При этом употребляется только один краситель, чаще всего фуксин (красный цвет) или метиленовая синька (синий цвет). Фуксин красит быстрее (1-2 мин), интенсивнее и окрашивает все виды бактерий. Метиленовая синька красит медленнее (3-5 мин), менее ярко, но препараты получаются более четкими. Простую окраску препаратов применяют, главным образом, для обзорной микроскопии.
Сложные способы окраски заключаются в последовательном применении нескольких красителей. Они служат для дифференциации видов микроорганизмов по способности к окрашиванию (тинкториальные свойства) или для выявления отдельных клеточных структур.
Универсальным методом из сложных способов окраски является окраска по методу Грама. Она является дифференциальной и широко используется для определения видовой принадлежности бактерий. По способности окрашиваться по методу Грама все бактерии делятся на грамположительные (гр+) и грамотрицательные (гр-).
Грамположительные бактерии удерживают комплекс красителя генцианвиолетового с йодом при обработке спиртом и поэтому окрашиваются в сине-фиолетовый цвет; грамотрицательные бактерии не обладают такой способностью, обесцвечиваются спиртом и при последующей обработке фуксином они приобретают красную окраску.
Способность бактерий окрашиваться по Граму в настоящее время связывают с молекулярной организацией и химическим составом клеточной стенки бактерий.
Техника окраски состоит в следующем:
1) на фиксированный мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги, наливают 2-3 капли генцианвиолета и окрашивают в течение 2-х минут;
2) бумагу снимают и, не промывая водой препарат, наносят на мазок 2-3 капли раствора Люголя, выдерживая реактив 1-2 мин;
3) сливают реактив Люголя;
4) промывают препарат водой;
5) наносят на мазок 96%-й этиловый спирт и выдерживают его в течение 30 с для обесцвечивания красителей;
6) промывают препарат водой;
7) для дополнительной окраски наливают на мазок водный раствор фуксина на 1 – 2 мин;
8) промывают препарат водой, промокают фильтровальной бумагой и
микроскопируют с иммерсионным объективом.
Бактерии, окрашенные в синий цвет, относятся к грамположительным, а красные – к грамотрицательным. Отношение к окраске по Граму является важным опознавательным признаком бактерий, что обязательно упоминается в их характеристике.
Внимание! При окраске по Граму возможны следующие ошибки:
- все клетки синие из-за недостаточного обесцвечивания;
- все клетки бледно-розовые вследствие недостаточного окрашивания генциановым виолетовым или чрезмерной обработки спиртом;
- редкие клетки в поле зрения – плохо выбрано поле зрения препарата;
- чрезвычайно много микробов в поле зрения - плохо приготовлен мазок.
Для получения правильной окраски рекомендуется употреблять свежие (суточные) культуры микроорганизмов, поскольку старые культуры меняют свое отношение к окраске по Граму.
Задание:
1) Приготовить препараты «висячая» и «раздавленная» капли и рассмотреть под микроскопом подвижность бактерий.
2)Приготовить фиксированные препараты стафилококков, диплококков, тетракокков, сарцин, микрококкков, спороносных и аспорогенных палочек, окрасить их по методу Грама и рассмотреть с иммерсионным объективом.
3)Оформить протокол исследования, зарисовать все рассмотренные препараты бактерий, условно обозначив поле зрения кругом. Под рисунком следует указать форму каждого вида бактерий, отношение к окрашиванию по Граму, общее увеличение микроскопа.
Например:
диплококки, гр(+), ув.90 хх15 х=1350 х.
К о н т р о л ь н ы е в о п р о с ы:
1) Правила работы с культурами микроорганизмов.
2) Как приготовить препараты для прижизненной микроскопии микробов? Каковы преимущества и недостатки этого метода?
3) Техника приготовления фиксированного препарата.
4) Какие существуют способы фиксации и окраски бактериальных препаратов?
5) Методика окрашивания бактерий по методу Грама.
6) От чего зависит разница в окрашивании препарата методом Грама?
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №3.
