Методы выделения и идентификация

Для выделения флавоноидов проводят экстракцию раститель­ного материала, как правило, одним из низших спиртов. Спиртовое извлечение упаривают, к остатку добавляют горячую воду и после охлаждения удаляют^ нёполярные соединения (хлорофилл, жирные масла, эфирные масла и др.) из водной фазы хлороформом или четыреххлористым углеродом. Флавоноиды из водной фазы извле­кают последовательно этиловым эфиром (агликоны), этилацетатом (в основном монозиды) и бутанолом (биозиды, триозиды и т. д.).

Для разделения компонентов каждой фракции используют ко­лоночную хроматографию на силикагеле, полиамидном -сорбенте или целлюлозе. Элюирование веществ проводят смесью хлороформа с метиловым спиртом с возрастающей концентрацией метилового спирта, спирто-водными смесями с возрастающей концентрацией спирта, если сорбентом служит полиамид, или 5—30 %-ной уксус­ной кислотой в случае целлюлозы.

Для выделения отдельных флавоноидов существуют специфиче­ские методы. Так, для выделения рутина из бутонов софоры япон­ской экстракцию проводят горячей водой. При охлаждении водных извлечений рутин выпадает в осадок, его отфильтровывают и очи­щают перекристаллизацией из, спирта.

Для идентификации флавоноидов используют их физико-хими­ческие свойства: 1) определение температуры- плавления; 2) опре­деление удельного вращения (ta]_D гликозидов); 3)-сравнение УФ, ИК, масс-, ПМР спектров со спектрами известных образцов.

УФ спектр флавоноидов характеризуется наличием, как пра­вило, двух максимумов поглощения. Положение максимумов и их интенсивность характерны для различных групп флавоноидов. Флавоноловые гликозиды производные кверцетина (например, ру­
гин) имеют 2 максимума поглощения при 258 и 361 нм и «плечо» 266 нм. Для целей идентификации вещества используются положе- яия максимумов и «плеча», величина £}%. Эта величина для рутина равна 325,5, в случае моногликозида кверцитрина она лежит в пре­делах 350, в то время как у агликона (кверцетина) составляет 718. УФ спектроскопия успешно используется для установления сво­бодных ОН-групп в молекуле флавоноида путем добавления различ­ных реактивов (ацетата натрия, метилата натрия, борной кислоты: ацетатом натрия, хлористого алюминия и т. д.). При добавлении этих реактивов происходит смещение максимумов поглощения, ха­рактерное для гидроксильных групп в различных положениях.

В ИК спектре флавоноидов имеются полосы поглощения, ха­рактерные для различных группировок. Так, рутин имеет широкую полосу 3200—3500 см^-1, обусловленную фенольными и спиртовыми гидроксильными группами: полоса 1660 см^-1 принадлежит карбо­нильной группе; ароматические С=С-связи дают ряд полос 1610, 1580, 1510, 1460 см^-1. Важной для идентификации флавоноидов является так называемая область «отпечатка пальцев» 80Ю— 1200 см"¹. Совпадение полос указанных группировок и области «отпечатка пальцев» служит надежным признаком- идентичности веществ.

Качественное определение

Общие реакции, специфичные для всех групп флавоноидов, от­сутствуют. Наиболее часто используются следующие реакции.

1. -Цианидиновая реакция или проба Chinoda. Флавонолы, фла- ваноны и флавоны при восстановлении магнием в присутствии соля­ной кислоты дают красное или оранжевое окрашивание, обуслов­ливаемое образованием антоцианидинов: •

 

/ОН

,,, О-^0Н

HON

Ан А ^[2]*

,01

Mg+Hci ^H0YY°vrS-<

,OH -OH hci -н,о

Г2Н1+"*» I

^{L 1}

НОН^{х N}OH хроиенол

 

ОН л ОН

 

С1-

ОН

Цианвднн хлорид

Халконы и" ауроны цианидиновой реакции не дают, но при д бавлении концентрированной НС1 (без магния) образуют краен окрашивание за счет образования оксониевых солей.

2. Борно-лимонная реакция. 5-оксифлавоны и 5-оксифлавонолы взаимодействуют с борной кислотой в присутствии лимонной (или щавелевой), образуя ярко-желтое окрашивание с желто-зеленой флуоресценцией (образование батохромного комплекса):

 

3. Реакция с треххлористой сурьмой. 5-оксифлавоны и 5-окси­флавонолы, взаимодействуя с треххлористой сурьмой, образуют комплексные соединения, окрашенные в желтый или красный цвет:

\

 

широко используется хроматография на бумаге и в тонком слое сорбента. Обнаружение компонентов на хроматограмме осуществля­ется просматриванием их в УФ свете. При этом флавоны, флаво- нол-З-гликозиды, флаваноны, халконы обнаруживаются в виде ко­ричневых пятен; флавонолы и их 7-гликозиды — в виде желтых или желто-зеленых пятен; ксантоны в виде оранжевых пятен. Изо- флавоны при этом не проявляются. После просматривания в УФ свете хроматограммы можно обработать одним из реактивов (5%-ным спиртовым раствором А1С1₃ с последующим нагреванием при 105 °С в течение 3—5 мин; 5%-ной SbCl_s в четыреххлористом углероде; 2%-ным спиртовым раствором щелочи), что позволяет получить зоны с более яркой флуоресценцией в УФ свете. •

Методики качественного определения. Приготовление извлечения из растительного сырья: 1 г измельченного сырья (трава гречихи, - бутоны софоры японской, цветки пижмы, копеечника желтеющего и др.) помещают в колбу вместимостью 25 мл и заливают 10 мл эти­лового спирта. Колбу соединяют с обратным холодильником и на­гревают на водяной бане в течение 10 мин с момента закипания спирта в колбе. После охлаждения полученное извлечение фильт­руют через бумажный фильтр.

Качественные реакции. 1. Цианидиновая проба (проба Chinoda). К 2 мл извлечения добавляют 5—7 капель концентрированной НС1 и 10—15 мг металлического Mg или Zn, через 3—5 мин наблюдается красное, оранжевое, розовое окрашивание. Для ускорения реакции и усиления окраски рекомендуется подогреть реакционную смесь (2—3 мин) на кипящей водяной бане.

2. Реакция с раствором основного ацетата свинца. К 1 мл извле­чения добавляют 3—5 капель 2%-ного основного ацетата свинца. Появление желто-оранжевого окрашивания свидетельствует о на­личии флавоноидов.

Хроматографическое определение. На круг-^ лый диск хроматографической бумаги на расстоянии 0,5 см от центру наносят исследуемые извлечения травы гречихи, бутонов софоры» травы копеечника желтеющего и в качестве «свидетелей» — спиртов вые растворы рутина и кверцетина. Диаметр пятна не должен npejj вышать 5 мм. В центр диска вводят фитиль из хроматографической бумаги. Хроматографирование проводят в чашках Петри, в качеству растворителя используют 15%-ную уксусную кислоту. Экспозиций 20—25 мин. Хроматограммы высушивают до испарения раствори-! теля и просматривают в УФ свете. Отмечают зоны: рутина (корич^ невая), хлорофилла (красная), кверцетина (желтая), ксантонов (оранжевая). Обрабатывают хроматограмму парами аммиака, от* мечают переход окраски в желто-зеленую или опрыскивают 1 %-ньа| спиртовым раствором хлорида алюминия или хлорокиси циркония! После высушивания хроматограммы повторно просматривают i УФ свете. Образуются ярко флуоресцирующие желто-зелень^ комплексы с А1 (III) или Zr (III). ]

Реактивы и оборудование: этиловый спирт (этанол); Н<| (конц.); Mg (металл.); свинца ацетат основной (2%-ный раствор); уксусная киО

88 1 лота (15%-ная); А1С1₃ (10%-ный раствор в этиловом спирте); рутин; квер- цетин.

Бумага хроматографическая; бумага фильтровальная; колбы с нормальным шлифом вместимостью 25 мл; колбы конические вместимостью 25 мл; воронки стеклянные для фильтрования диаметром 5 см; пробирки стеклянные; капилляры стеклянные; чашки Петри; УФ лампа.