Физико-химические свойства фенольных соединений.

Соон

 

§ 2. Физпко-химнчеекпе свойства

Фенольные гликозиды в индивидуальном состоянии представляют собой белые кристаллические вещества, растворимые в воде, эти­ловом спирте, ацетоне, нерастворимые в этиловом эфире и хлоро­форме. Все фенольные гликозиды оптически активны в связи с при-

дствием в их молекуле углеводного компонента (как правило,

ИОКОЗЫ).

Фенольные гликозиды, как и все О-гликозиды, характеризуются юсобностью к гидролизу при нагревании с минеральными кисло- 1ми или при термостатировании с ферментами.

При гидролизе расщепление происходит до углеводного компо-:нта и соответствующего агликона. Подобный гидролиз происхо- IT и в живом организме под действием ферментов; при этом пер- шными продуктами метаболизма фенольных гликозидов являются ликон и сахар.

§ 3. Методы выделения и идентификация

Фенольные гликозиды извлекают из растительного материала иловым и метиловым спиртами (96, 70 и 40°). В дальнейшем истку спиртовых извлечений ведут общепринятым для гликози- в методом.

Выделение индивидуальных соединений проводят, как правило, годом адсорбционной хроматографии на полиамиде, силикагеле, члюлозе. В качестве элюирующих смесей используются вода юдный спирт, если адсорбентом служит полиамид или целлюлоза, 5о различные смеси органических растворителей для всех пере­менных адсорбентов.

Фенольные гликозиды в лекарственном растительном сырье -ут быть идентифицированы хроматографией в тонком слое)бента или на бумаге.

Для хроматографирования в тонком слое сорбента используют темы растворителей: 1) н-бутанол — уксусная кислота — вода 1 1 5); 2) н-бутанол — уксусная кислота — вода — ксилол 2:3:4); 3) хлороформ — метиловый спирт (8: 2). При хроматографировании на бумаге используют 5, 10, 15%-ную усную кислоту.

Для индивидуальных веществ определяют температуру плавле-, удельное вращение, снимают УФ и ИК спектры. Рассмотрим и ИК спектры на примере арбутина. В связи с наличием в моле- е фенольных гликозидов ароматических С—С-связей фенольные козиды имеют максимум поглощения в УФ спектре при 2*70— нм. Максимум поглощения арбутина находится при 287 нм ожет быть использован как для качественной характеристики, и количественного определения арбутина в растительном мате- ле.

3 ИК спектре арбутина имеются характерные полосы при)—3400 см"¹, обусловленные наличием спиртовых и фенольных юксильных групп; полоса 1515, 1460, 1440 см"¹ типична для этических С=С-связей. Имеется ряд полос в области 800— ¹ см"¹ (область «отпечатка пальцев»). Совпадение спектров иссле- юго гликозида со спектром достоверного образца указывает дентичность соединений. Для идентификации фенольных гли-
козидов широко используются химические превращения (гидро­лиз, ацетилирование, метилирование и т. д.) и сравнение констант продуктов превращения с литературными данными для предпола­гаемого гликозида.

§ 4. Качественное определение

Фенольные гликозиды, имеющие свободную гидроксильную группу, дают все реакции, характерные для фенолов, например, с железоаммониевыми квасцами, реакцию диазотирования и др.

В случае если фенольный гидроксил гликозилирован, как у салицина, реакции проводят после предварительного гидролиза гликозида кислотами либо ферментами. Эти же качественные реак­ции используют для обнаружения феноль- ных гликозидов на хроматограммах.

В случае хроматографирования в тонком слое силикагеля хроматограммы можно обра­ботать кроме перечисленных реактивов еще и 4%-ной H₂S0₄ в абсолютном этиловом спирте.

При этом фенольные гликозиды в зави­симости от строения обнаруживаются в виде желтых, красных, оранжевых или голубых пятен.

При обработке хроматограмм раствором нитрата серебра и щелочью фенольные гли­козиды обнаруживаются в виде коричневых пятен с различным оттенком. При обработке хроматограмм реактивом Паули фенольные гликозиды в зависимости от строения прояв­ляются в виде желтых, оранжевых или крас­ных пятен.

Методики обнаружения арбутина в ли­стьях толокнянки и брусники. 1. 0,5 г из­мельченного сырья кипятят с 10 мл воды 2—3 мин и после охлаждения фильтруют. К 1 мл фильтрата прибавляют кристаллик сульфата закисного железа; жидкость окра­шивается сначала в сиреневый, затем темно-фиолетовый цвет, и, наконец, образуется темно-фиолетовый осадок (арбутин).

2. К 1 мл фильтрата (в фарфоровой чашке) прибавляют 4 мл раствора аммиака и 1 мл 10%-ного раствора натрия фосфорно-молиб- деновокислого в 10%-ной НС1; появляется синее окрашивание (арбутин).

Рис. 8. Схема бумаж­ной хроматограммы (БХ) фенологликози- дов толокнянки и бру­сники:

1 — извлечение из листь­ев толокнянки: 2—из­влечение из листьев бру­сники; 3 — раствор ар­бутина

3. 0,5 г мелкоизмельченного растительного сырья заливают 5 мл этилового спирта и экстрагируют при периодическом встря­хивании и слабом нагревании на водяной бане в течение 1 ч. Полу­ченное извлечение с помощью капилляра наносят на бумагу (3— 4 прикосновения капилляра) и хроматографируют восходящим
способом в 5%-ной уксусной кислоте до прохождения фронта растворителя 15—17 см (хроматограмма проходит в течение 1 ч при использовании бумаги FN-3). Хроматограмму вынимают, вы­сушивают, обрабатывают раствором 10%-ной спиртовой щелочи и затем реактивом Паули. Арбутин имеет самое высокое значе­ние R_f — 0,75, отделяется от сопутствующих гликозидов и про­является в виде ярко-красного пятна (рис. 8). Аналогичные результаты можно получить на пластинке «Силуфол» при хрома-' тографировании в системе хлороформ — этиловый спирт (7: 3) с последующей обработкой раствором щелочи и реактивом Паули.

Хроматограммы до и после обработки реактивами целесообразно просматривать в УФ свете с целью идентификации сырья по отдель­ным компонентам.

§ 5. Количественное определение

Нормативно-техническая документация (НТД) предусматривает количественное определение арбутина в листьях толокнянки и брус­ники. Метод определения основан на иодометрическом титровании гидрохинона, полученного после извлечения и гидролиза арбутина. Разработан спектрофотометрический метод определения салидро- зида в экстракте из корневищ с корнями радиолы розовой, который можно использовать для количественного определения салидро- зида в растительном материале. Исходя из строения фенольных гликозидов и их УФ спектров, возможно количественное хромато- спектрофотометрическое определение всех представителей этой группы.

Методика количественного определения арбутина в листьях толокнянки (Folium Uvae ursi) и листьях брусники (Folium Vitis idaeae). Около 0,5 г (точная навеска) сырья, измельченного и про­сеянного через сито с диаметром отверстий 1 мм, помещают в колбу вместимостью 100 мл, заливают 50 мл воды и кипятят 30 мин. Горячее извлечение фильтруют в мерную колбу вместимостью 100 мл, избегая попадания растительного материала на фильтр. Растительный материал в колбе заливают 25 мл воды и кипятят 20 мин. Горячее извлечение вместе с растительным материалом переносят на фильтр, фильтруют и остаток на фильтре промывают дважды по 10 мл горячей водой. К фильтрату в мерной колбе добав­ляют 3 мл раствора ацетата свинца, перемешивают и по охлажде­нии доводят объем до метки. Колбу нагревают на кипящей водяной бане до полного створаживания осадка. Горячую жидкость филь­труют в колбу, охлаждают, добавляют 1 мл концентрированной H₂S0₄, колбу взвешивают, соединяют с обратным холодильником и кипятят при слабом кипении 1,5 ч. После охлаждения потерю в массе восстанавливают добавлением воды и жидкость фильтруют, к фильтрату добавляют 0,1 г цинковой пыли и встряхивают 5 мин. Жидкость нейтрализуют по лакмусовой бумажке гидрокарбонатом натрия, добавляют еще 2 г гидрокарбоната натрия и после его растворения фильтруют в сухую колбу. К 50 мл фильтрата прибав­ляют 200 мл воды и немедленно титруют из полумикробюретки 0,1 н. раствором иода до синего окрашивания, не исчезающего в течение 1 мин (индикатор — крахмал).

1 мл 0,1 н. раствора иода соответствует 0,01361 арбутина. Процентное содержание арбутина в растительном материале х в пересчете на абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле

_ У0,01361 - 2-100 -100 * от (100—w) '

где V — объем 0,1 н. раствора иода, израсходованного на титро­вание, мл; т — масса навески сырья, г; w — потеря в массе сырья при высушивании, %.

Содержание арбутина в сырье регламентируется НТД.

Реактивы и оборудование: этиловый спирт (этанол); уксусная кислота 5%-ная; NaOH, 10%-ный раствор в метиловом спирте; реактив Паули; свинца ацетат (раствор); H₂S0₄ (конц.); сульфат закисного железа; цинковая пыль; натрия гидрокарбонат; иод 0,1 н. раствор; крахмал.

Бумага хроматографическая; пластинки стеклянные; камера хроматогра­фическая для БХ; колбы конические вместимостью 100 и 500 мл; полумикробю­ретки; воронки стеклянные для фильтрования диаметром 5 см; бумага фильтро­вальная.

ФЛОРОГЛЮЦИДЫ

Флороглюциды — одна из групп природных соединений, доволь­но широко распространенных у представителей рода щитовник. Они представляют большой интерес для практической медицины, имеют еще не совсем изученный химический состав. В настоящее время насчитывается не более 50 природных веществ с установлен­ной структурой.

Эти соединения обладают различным биологическим действием: антигельминтным, желчегонным, противовирусным, противонар- котическим и др. В качестве официнального в СССР и в большинстве фармакопей других стран включено корневище мужского папорт- ника семейства многоножковых. Некоторые фармакопеи зарубеж­ных стран допускают использование корневищ папоротников авст­рийского, игольчатого, раскидистого.

§ 6. Классификация

Флороглюциды являются соединениями, производными флоро- глюцина или пирона. Они встречаются в виде мономеров или ве­ществ, связанных группой (—СН₂) в димеры, тримеры или тетра- меры. Мономерные соединения в свою очередь подразделяются на: а) бутирилфлороглюцин и его производные; б) метилбутирилфло-

н₃с_ч,сн_я

J

НО-/\-ОН HO-/V-OH НО-/\-ОН |_с с н._! с г н!

\/ ^{3 7} I ⁸⁷ \/

ОН ⁰ (i)H ⁰ о

бутирилфлороглюцин метилбутирилфлоро- филициновая

глюцнн кислота

К димерным веществам относятся: а) производные бутирилфло- роглюцина и метилбутирилфлороглюцина, например флораспиди­нол; б) производные ацилфилициновых кислот: альбаспидин и его гомологи; в) производные ацилфилициновых кислот, бутирил- флороглюцина, метилбутирилфлороглюцина, флаваспидовая кис­лота и ее гомологи, и др., например, флаваспидовая кислота; г) производные 2,3-дигидро-2-окси-6-пропил-у-пирона (флораспирон и флоропирон):

СН,

НО-/\-ОСН, н,СО-У\-ОН НА-С i I J—с—с₃н₇

,1 у \ /У [ о Ан \_сн/ Ан о

флораспидинол

НзСч^^СНз Н/^СН,

НО——ОН ОН—ОН Н₇С₃-С-^_Х 1]__С-С₃Н₇

О А \сн/ i о

альбаспидин

Н₃С_Х/СН₃

НО—/\-0Н НО-/\-ОН н₇с₃-с-^_х А/-С-С₃Н₇

А \сн/ Т_н А

флаваспидовая кислота

HA-/°Vo H£Q-/VOH

^{9 1} V)-С-С₃Н₇

\сн/ Ан ⁶

флораспирон

роглюцин и его "метоксилированные производные; в) филициновая кислота и ее производные: СН,

Из тримерных соединений известно не более 5 веществ с уста­новленной структурой. Так, из папоротника мужского выделена

К тетрамерным соединениям относят два известных в настоящее время природных вещества, одно из них метилен-бмс-норфлаваспи- довая кислота.

филиксовая кислота:

НА-'

—С—QH7

Н-Ггн. СОС3Н7 н г гц Н< Н

§ Л. Физико-химические свойства флороглюцидов

Флороглюциды обладают кислотным характером, обусловлен­ным гидроксильными группами, связанными с ароматическим кольцом. Бензольное кольцо, вступая в реакцию с целым рядом реагентов, дает соединения с характерной окраской, что использу­ется для обнаружения флороглюцидов в растениях. Флороглюцино- вые производные при отсутствии в их структуре пространственных затруднений способны к образованию межмолекулярных и внутри­молекулярных связей. Они имеют характерную область поглощения в УФ спектрах (215—240 и 240—380 нм); кристаллизуются в виде веществ желтого, реже белого цвета; нерастворимы в воде, раствори­мы в органических растворителях (избирательно), хорошо — в ще­лочах и жирных маслах.

§ 8. Методы выделения и идентификация

Выделение производных флороглюцина из растительного сырья проводят экстракцией различными органическими растворителями: этиловым эфиром, хлороформом, ацетоном, этиловым и метиловым

%%

ЯП Рис. 9. И К спектр аспидинола

 

спиртами. Получаемый после отгонки растворителя густой экстракт обрабатывают водным раствором гидроксида бария, оксида магния и т. д., в результате чего флороглюциды переходят в феноляты.

Водные растворы затем подкисляют концентрированными соляной, серной или уксусной кислотами, при этом в осадок выпадает сумма флороглюцидов, называемая сырым филицином.

Хроматографический метод считается наиболее подходящим для разделения производных флороглюцина и чаще всего используется

при изучении этих веществ. Для этих целей применяют бумажную хроматографию, хроматографию в тонком слое сорбента и хромато­графический метод разделения на колонках. Адсорбентом служат си- ликагель, диоксид кремния, поли­амид, оксид алюминия. В качестве подвижной фазы используются смеси: петролейный эфир — хло­роформ (1: 1); бензол — хлоро­форм (1: 1); циклогексан — хло-. роформ (1: 1); гексан — петролей-

'2W 260--------- Ш----- зЬ—AjiM ^{ный Э}Ф^ИР (1! 1) с 5 % этилового

спирта и др. На хроматограмме для Рио. 10. УФ спектр аспидинола обнаружения производных флоро­глюцина используют их свойства флуоресцировать в УФ свете, а также давать окрашенные соеди­нения с диазореактивами.

Строение веществ устанавливается на основании элементного анализа, температуры плавления, получения производных, в ре­зультате щелочного гидролиза (у ди- и полимеров), УФ, ИК, ПМР и масс-спектроскопии. На рис. 9 и 10 приведены данные спектра УФ и ИК для мономера аспидинола, выделенного из корневищ мужского папоротника.

§ 9. Качественное определение

Получение извлечения: 1 г Измельченного сырья помещают в кол­бу с притертой пробкой, заливают 4-кратным количеством хлоро­форма (этиловый, метиловый спирт) и оставляют на сутки, перио­дически взбалтывая. Затем фильтруют через бумажный фильтр (извлечение «А»).

Получение сырого филицина. 10 г измельченных корневищ сырья заливают восьмикратным количеством этилового спирта, взбалты­вают в течение 30 мин и оставляют на 3 ч для экстракции. Извле­чение фильтруют и упаривают в вакууме при температуре 55—60 °С до густой консистенции. Остаток обрабатывают несколько раз насы­щенным раствором гидроксида бария и фильтруют. Фильтрат под­кисляют концентрированной НС1 до рН 2,0. Выпавший осадок сы­рого филицина отфильтровывают, промывают дистиллированной водой и высушивают в эксикаторе.

ige ¥ 3,5 3.0

Методики качественных реакций. 1. К 1 мл извлечения добавляют 3—5 капель смеси равных объемов 1 %-ного раствора FeCl₃ и K₄Fe(CN)_e. Образуется темно-зеленое окрашивание.

2. К 1 мл извлечения добавляют 2—3 капли реактива Паули по Кутачеку: вишнево-красная окраска переходит в оранже­вую.

3. К 1 мл извлечения прибавляют раствор ванилина в концентри­рованной НС1: появляется красное окрашивание.

4. К 1 мл извлечения добавляют раствор FeCl₃, K₄Fe(CN)_e (1: 1) и 10 капель концентрированной НК0₃. Образуется темно-бурое окрашивание.

5. Хроматографическое определение. На пластинку «Силуфол», пропитанную лимонно-фосфатным буфером (рН 6,0), с последующим активированием пластинки при температуре 70—80 °С (1 ч) наносят 1 °о-ный сырой филицин из мужского па­поротника (5—6%-ный раствор из иголь­чатого папоротника) в хлороформе капил­ляром в одно касание на стартовую линию хроматографической пластинки, высота жидкости в капилляре 1,5—2 см, диаметр полученного пятна 2—3 мм. Высушенную пластинку помещают в хроматографиче- скую камеру со свежеприготовленной, на­сыщенной системой н-гексан — хлороформ (1 1) с 5 % этилового спирта. Время хроматографирования 1 ч. Хроматограмму высушивают на воздухе и просматривают в УФ свете, отмечая зону флуоресценции. Проявляют флороглюциновые производ­ные реактивом Паули по Кутачеку, отме­чая цвет пятен (рис. 11).

В мужском папоротнике обнаружива­ются не менее 6 пятен, из них иденти­фицированы флаваспидовая кислота, ас- пидинол, альбаспидин; в игольчатом папо­ротнике не менее 8 пятен, для 4 из них установлено строение (флаваспидовая кислота, аспидинол, дезас- пидин и аспидин).

Хроматографическое разделение можно проводить в тонком слое силикагеля марки КСК, смешивая 4 г силикагеля с 10 мл лимонно- фосфатного буфера с рН 6,0 и последующим активированием- пла­стинки в течение 1 ч при t = 105—110 °С в той же системе.

а " «4Ш» 0 даяа S ф Ь # а I I I ® О /

Рис. 11. Схема хромато граммы (ТСХ) флороглю- цинов игольчатого и муж­ского папоротников: 1 — раствор сырого филици­на из корневищ игольчатого папоротника; 2 — раствор сырого филицина из корне­вищ мужского папоротника; а — аспидин, б — дезаспи- дин, в — аспидинол; ггх — флаваспидовая кислота (тау- томерные формы); д — аль баспидин

§ 10. Количественное определение

Методы количественного определения производных флороглю- цина ограничивались в фармакопеях различных стран только опре­делением сырого филицина. В литературе имеются сведения о раз­работке хроматоспектрофотометрических методов определения фло-

3 п/р Гринкевнч и др.

роглюцидов в кристаллическом порошке и сырье, в частности для флаваспидовой, ацетилфлаваспидовой кислот, аспидина, аспиди- нола. Метод основан на способности поглощать фенольные соеди­нения в УФ области при определенных длинах волн, характерных для этого класса соединений.

Методика определения суммы сырого филицина из корневищ муж­ского папоротника — Rhizoma Filicis maris (Dryopteris filix mas L.) (ГФ X, ст. 584). 50 г псрошка корневищ экстрагируют около 2 ч в аппарате Сокслета этиловым эфиром до тех пор, пока эфир не будет стекать бесцветным и 10 мл эфирного извлечения не перестанут оставлять при испарении видимого остатка. Извлечение фильтруют, эфир отгоняют на водяной бане до 30 мл, после чего остаток взбал­тывают в делительной воронке с 30 мл насыщенного раствора гидро- ксида бария в течение 5 мин. После разделения слоев водный слой фильтруют. 24 мл фильтрата (40 г сырья) смешивают с 4 мл концен­трированной НС1 и последовательно взбалтывают с 30, 20, 15 мл этилового эфира. Объединенные эфирные извлечения обезвоживают 4 г безводного Na₂S0₄ и фильтруют через складчатый фильтр во взве­шенную колбу. Сульфат натрия и фильтр промывают этиловым эфиром дважды по 10 мл. Эфир отгоняют на водяной бане, а остаток сушат в течение 1 ч при 100 °С. Процентное содержание филицина х рассчитывают по формуле

_ а\00 -100 т (100 —ш) '

где а — количество сырого филицина, полученного после отгонки этилового эфира, г; т — масса навески сырья, вычисленная по отмеренному объему фильтрата, г; w — потеря в массе сырья при высушивании.

Содержание сырого филицина в корневищах должно быть не менее 1,8 %.

Реактивы и оборудование: лимонная кислота; натрия фосфат двузамещенный; Ва(ОН)₂; стрептоцид белый; NaN0₂; FeCl₃; K4Fe(CN)_e; ванилин; хлороформ; к-гексан; этиловый спирт (этанол); н-бутанол (бутанол-1); НС1 (конц.); этиловый эфир; Na₂S0₄; реактив Паули по Кутачеку [белый стрептоцид (3 г); н-бутанол (14 мл); НС1 (конц., 6 мл); вода дистиллированная (200мл), хранятв тем­ной склянке, в реактив перед употреблением добавляют натрий нитрит кристал­лический]; лимонно-фосфатный буфер с рН 6,0 [смесь двух растворов (раствор А — 0,2 М Na₂HP0₄ и раствор В —0,1 М лимонной кислоты)]. Для получения 20 мл буфера смешивают 12,63 мл раствора А и 7,37 мл раствора В (рН прове­ряют по универсальному индикатору).

Аппарат Сокслета; силикагель марки KCK; шкаф сушильный лаборатор­ный; колба круглодонная с нормальным шлифом вместимостью 500 мл; бани во­дяные лабораторные; воронки стеклянные для фильтрования диаметром 5— 10 см; холодильник стеклянный лабораторный; фильтры бумажные; пробирки стеклянные; камера хроматографическая для ТСХ; капилляры стеклянные; пла­стинки «Силуфол»; пластинки стеклянные для ТСХ размером 20 X 20 см; пуль­веризатор; колбы конические вместимостью 100 мл; весы ручные; весы лабора­торные аналитические; ступки фарфоровые с пестиком или кофемолка электри­ческая бытовая.

Вопросы для подготовки

Физико-химические свойства фенольных соединений.